芯片的构建和阅读
Vivian G. Cheung, Michael Morley, Francisco Aguilar,
Aldo Massimi, Raju Kucherlapati & Geoffrey Childs
联合基因科技有限公司 吴凌凌 译
摘要
制作芯片和获得芯片的数据有许多不同的方法。这里我们介绍了在学术领域中两种芯片的构建和使用。除了详细说明了技术细节外，我们还对组成和方法的优缺点进行了评论，同时还介绍了杂交的方法。用我们所建立和使用芯片的方法来回答生物领域问题的事实证明了这种技术在大学的环境下是可行的。
一种获得基因功能信息的高通量的方法是cDNA芯片。在一块显微镜载玻片上包含了几百至几千个固定的DNA样本，以类似于Northern blot 和 Southern blot的方法进行杂交。了解了这个方法后，我们决定在我们各自的实验室Pennsylvania大学（Penn）和Albert Einstein学院医学部（AECOM）制作了高速，高精度的芯片。这个设备是由Stanford医学院Pat Brown制造的，第一次论证了这个方法的可行性。我们的目标是（1）最终以合理的价格，用一块或几块芯片来检测哺乳动物细胞中每个基因的表达，（2）发展以芯片为基础的绘图方法，（3）兼顾硬件和超作方法，尽可能地提高灵敏度。
玻片的优势
一个理想化的支持物允许探针有效地固定在其表面，探针与目标分子能牢固地杂交结合。与另一种用于制作芯片的标准支持物尼龙一样，玻璃有许多的优点。它也有其特长。首先，DNA样品以共价键的形式结合在处理过的玻片上。第二，玻璃是一种耐用的材料，能够耐高温和高离子强度溶液的洗涤。第三，玻璃不是多孔材料，使杂交的容量能保持在最小，因此能提高探针与目标分子的退火效率。第四，由于材料的低荧光性，不会有背景的影响。最后，两种不同的探针能够标上两种不同的荧光标记，在一片芯片上同一个反应中同时孵育；尼龙就受到连续或平行杂交的限制。
芯片需要大量的探针固定（或排列）在玻片上，这里我们描述了AECOM芯片，扫描仪以及进行了关于设计和操作的讨论。如果想得到关于Penn芯片的信息，请到http://w95vcl.neuro.chop.edu/vcheung查找。
自动化装置性质
AECOM点样仪，Albert，产生高密度的分隔的矩阵，矩阵包括cDNA、基因组DNA或其他类似的生物物质。机械的基本组成有计算机控制的三轴向的机械手和独特笔尖装置。
设计特点
机械手被设计成能自动从96或384孔的微量滴定板中选取样本，12支点样笔同时升起，每个点样笔收集了250-500nl溶液，在每块玻片上放置0.25-1nl，产生的点的大小范围直径为100-150μm。机械手是由设置好的程序控制的，能进行连续的点样，每一点避免与相邻的点接触，每点的中心距离大约为200-250μm。检测的精密度大约是10μm。机械手放置在可视工作平台上（Newport公司），允许放置大量的显微镜玻片，微量滴定板，三个洗涤装置和一个干燥装置。
洗涤装置是个固定的容器，装有蒸馏水，两次微量滴定板使用后需要更换。当笔尖浸过液体后，机械手要来回摇动点样笔（大约5Hz）来增加清洁程度。虽然我们认为没必要，但电脑控制的洗涤液可用超声波或流动的水来替代。干燥装置实际上是干/湿真空吸尘器（Sear公司，美国），接头与插入笔尖的限制插口相匹配。干燥器要做到在笔尖有快速流动的空气围绕，保持局部真空。
所设计的机械手的重要目的是要达到在最小的震动范围内的高速和高精确性。我们使用了保湿的可视工作平台，精密螺旋驱动地机械滑动，高分辨率的解码器的随动系统和沿着x轴方向的两侧支杆，避免了在一些系统中所见的悬臂结构。利用第二x轴的滑面来增加系统的固定性，能依次产生更快的定位以及通过工作平台的准确一致性。这些特点允许在精确率下的快速运动，使机械手能在一秒内对两块显微镜载玻片操作。
带有笔尖的点样笔支持物装置是一个重要的部分。我们的设计结合了线形运动，控制点样笔的方向，允许在最小的阻力下精确地纵轴运动，以防止在其他方向上的错位。我们设计的另一个独特之处是可调整的末端丝，允许在10μm的范围内校直每个点样笔的轴，以保证所有12支笔尖能在同一时间内接触显微镜玻片。而另一个没有这特点的设计需要与点样笔的精确长度一致以适应多点样笔的操作。每个点样笔由低强度的弹簧作为支持，保证在未接触表面时能回到伸展的位置。笔尖是由直径大约为1.6mm的不锈钢材料逐渐处理变细直至每点直径为100μm。再沿着中心垂直切割，在尖端分成两部分，每部部分5μm。
这个系统由可视基础程序控制的，在Microsoft Windous NT环境下运行，软件提供：印刷程序具体化；完成系统校正；显示真正地时间位置、速度和产生的错误；与其他功能参数一样重要的随动系统；动态地显示打印过程中的重要参数。随动系统控制的计算机中的插件能够动态地控制高速、复杂的机械手的动力，并设计成以它的运动来控制程序的语言。可视原理和随动插件运动控制程序相互作用，交换了参数、图象和所需的命令。微量滴定板的同一性是由扫描它的阅读器所决定的。由于有笔尖易被灰尘和纤维阻碍的问题，打印机现在被附上了软保护壁允许三个方向的随意进入并且合并了高效率效式空气过滤与吹风机以达到湿气的再流通。
操作
打印的第一步是将显微镜载载玻片以统一的形式排列在工作平台上，用在激光平台上的1孔作为引导，然后按下。膜微量滴定板固定器突然定位在平台的某一位置，用同样的孔来排列自己。同样的微量滴定板固定器保持在冲洗状态，也能被放置在任何方便的位置。使用者可任意选择保留的配置或进入配置中的参数。缓慢移动模式用于校验，使坐标位置正确。最后，使用者提示增加微量滴定板，机械手进入自动点样操作。点样笔从微量滴定板中收集样品并点样，从而对每块载玻片进行同样的操作。然后冲洗/干燥操作，再对新的样品进行重复操直到当所有的样品全部完成。在点样的过程中，程序自动地将同一来源的微量滴定板保留在磁盘上，优化每一点以及载玻片上的X-Y终点位置。这个文件稍后与基因说明文件合并，产生载玻片上已印好的点的复合说明。
观察
点大小的精确性依赖着笔尖的规格。尖端精细的槽口要求特殊的微加工工具就象Wire EDM。我们用的笔尖是TeleChem的，与我们的笔轴相匹配。它们的性能是可接受的，虽然它们是十分脆的。我们希望能获得有进展，更耐用的样式。
扫描仪特点
我们设计和制造的激光扫描仪IRIS，是Standford大学和国家健康研究所研制的器械的衍生产品，使灵敏度和动态范围最大化。我们也试图将运转的适应程度结合到设计中，因此在将来能够进行改进，允许更有效的荧光染料的测定（最近引进了DNA自动测序仪）。两个有染料标记的目标杂交后，玻片被扫描后产生16位TIF图象。每点的象素强度是与染料分子的数量以及与PCR产物斑点杂交探针数量成比例。
设计特点
激光扫描仪有一些关键的组成。软件是与HPVEE绘图程序语言同步的程序。规划图形的运动，控制A/D转换数据的捕获，处理两个频道的信号，显示每一次扫描的真实的时间参数，产生TIF文件的标题以及保存TIF图象的结果。八个样本引进的数据平均为每一个象素，转换为二进制整数，为校正图象的变化，轮流进行的扫描，然后保存。使用者可以看见大屏幕的示波境波形就是每次扫描的平均值，最小值和最大值统计。
操作
自动化分级操作搜索扫描模式，在X轴的方向上连续地通过显微镜载玻片，然后在Y轴的方向上移动一个象素的位置，产生一个bi-方向的光栅模式。X轴的信号解码器是由特殊设计的触发回路处理的，取消了每次扫描后的随动震动，产生了在所有方向上的A/D转换的清晰触发。回路保证了微米以下的空间分辨率和图象的线性结构。两条激光光柱合成联合直线，通过双重光束分割滤波器反射过目标，形成刺激显微镜载玻片上染料分子发荧光的精细聚焦光束。部分荧光是由目标分子捕获的，通过双光分裂滤波器发送，在滤波立方中分成红绿两种信号，在波段通过器中过滤。发送入各自的转换电信号的光电管（PMT0）中。每个光电管被A/D转换器放大，过滤和采样。转换器完成8个附加抽样，软件达到平均每象素8个样本，产生真实的16位分辨率的图象。
观察
我们最初获得了不恰当的信噪比，因此制定了双成分过滤器，（根据浓度）建立了我们规格，降低DC成分的干扰水平。立体过滤成分的去除，进一步改进了灵敏度。我们原先的设计有包括两个相配的聚焦镜的立体过滤器，小孔和不同的元件，这些如果组合在一起形成了共焦显微镜。但是我们发现光学共焦不能加强检测。事实上，镜头使干扰水平增加了两倍，这是由于自动的荧光性-整个装备导致了所需信号相当大的衰减，结果所有信噪比大大地减弱。我们因此推断在X轴方向的立体过滤在应用中没有起到作用。我们发现激光输出的清晰过滤对降低干扰是基本的。最后，为了达到可视成分的精细排列和精确的最佳聚焦，利用了刻度载玻片和软件，获得了高灵敏度的双物镜系统和广大的动态视野范围。
有时遇到的问题是镜子干扰的存在，由十分明亮但比我们所需的点的图象要小（<1μm-25μm）的信号组成。我们认为这是由于灰尘和没结合的染料所形成的。在干净的环境中操作，严格遵守杂交程序对减少这些影响是十分必要的。
在屏幕上显示的波形是可重复的。当比较同一行的重复扫描，我们发现极好的重复性。从中我们降低了由于扫描仪的光学和电子学因素而没传入的有用信号所产生的变形。当调节不同的控制参数时，这个显示能力也使我们精确地测量了在信号-干扰率上的影响。PMT冷却是包括在保持电子干扰最小化的设计中的。迄今为止，当PMT冷却到-18℃时，我们还没有找到在提高灵敏度方面的巨大进展。系统的干扰水平还没有达到电子干扰的水平，它的重要元件仍旧有光学干扰。可能是杂交进程中在载玻片上留下了一些自动显示荧光的残余。我们正开发新的方法来进一步减少干扰水平。
从目前系统的灵敏性来看，10 mW激光的能量看来是足够的，5mW就能产生令人满意的结果，并且显示了在这个区域中系统的增进是直线的。PMT的电压和激光能量是可交换的，不需要降低信号-干扰率。
性能
比较扫描仪的性能，通常没有可接受的标准。为了测定我们扫描仪的性能，通过利用一些包含不同浓度Cye3染料校准的载玻片来测定灵敏性。结果显示扫描仪能可靠地测定在100μm点上少于10-18 摩尔的染料的浓度。我们试图实现对染料结合和杂交能力测定的附加实验，但是性能显示我们用目前的探针预备方法能探测到低量的mRNA。初步的结果显示我们的扫描仪有比市场上的扫描仪高四倍的灵敏度，同时能处理多三倍的信号（在饱和状态前）。我们的扫描仪有超过1000倍的动态范围，明显比高密度过滤器的10倍的动态范围要好。我们能同时进行双色成像，但是是有限制的，因为有两个通道之间的干扰。这能通过在一个时间扫描一种颜色的方法而最小化，虽然当每块载玻片用两种以上的染料时，交叉激发仍能产生干扰现象。由我们的系统产生的典型的芯片，扫描用典型的12.8μm的象素大小，能产生16位分辨率的2048 by 1550象素的图象。每个点覆盖了大约100个象素，成像的扫描时间大约是40分钟。
杂交注意事项
DNA的数量。芯片上每点DNA的数量是可估计的。猜想每点堆积的形状是半球形的，它的容量是可以计算的：
一点的量=1/2 × (4/3πr3 )
每点的DNA的数量=样本的浓度 × 每点的量
斑点的容量少意味着用于杂交的探针的数量也很少，即使样本的浓度很高。必须努力减少这样的限制。一些因素必须考虑到，除了探针DNA的数量外，还有与目标分子相互补的探针DNA的比例，长短，目标分子的活性，就象用于检测信号方法的灵敏度影响着信号的强度。
杂交信号的浓度是与目标分子活性成比例的，与它的长度成反比，因此目标分子的特殊活性是十分重要的。每次实验的杂交时间也应该精确测量。
沉积机制
点样笔的精确切口允许利用毛细现象从微量滴定板中吸取样本。压力由点样笔向下的运动产生，载玻片的表面张力拖动样本从切口内到玻片上。点的大小依赖于点样笔向下及离开载玻片的加速度和载玻片表面的张力。点样笔向玻片的加速度与点的大小成比例，因此能调整到所希望的点的大小。当点样笔从玻片收回后，在切口内的样品和沉积在载玻片上的样本之间的流量就形成了。如果收回的速度很快尖端的量就被打断了，产生了大的点，不是完美的半球形。如果收回的速度十分慢，点样量就在尖端"修剪"了，留下的点就小。
DNA样本
样本准备在96孔的板上，乙醇沉淀并用70%的乙醇洗涤,然后在2×柠檬酸钠（SSC）中重建。样本浓度的重建依赖于所需点的大小和样本的粘稠度。如果样本需要排列为小的点，它们的浓度就要高。但是，限制因素是笔尖的设计，会使样本粘稠而难以排列，那些浓度大于2μg/μl的太粘了而不能点样。我们点样的目标浓度是每个样本15ng一个点。虽然我们在2SSC中重新建立了样本，但是溶液的离子浓度能在1×SSC到5×SSC之间而不影响杂交，然而样本溶解在溶液中后离子浓度高于5×SSC就很难与载玻片接触。
将DNA固定到玻璃片
在DNA排列到玻片上以后，它们是自然干燥的。样本的固定是通过紫外线（UV）固定的，形成在DNA上的胸腺嘧啶脱氧核苷残基和硅烷玻片上氨基之间的共价键。类似的方法也用于将DNA样本固定在尼龙膜上。为了完成最大化的杂交，要在紫外线交联之前，芯片要保持微量的湿润，通过将"排列"暴露在沸水中，然后在254nm的紫外线下暴露到0.27J/cm2 。我们发现精密测量照射的量是十分有利的，只要确定产生最佳信号的照射最佳水平。过长时间的照射导致了由于连接不充分而产生的DNA损失和个别地，DNA样本的过多的断裂。在交联后，过多的DNA分子在室温下被0.1%的SDS冲洗掉，然后在杂交以前，排列的样本在95℃的水中变性。
杂交中的
有许多方法使目标分子和探针进行杂交。我们发现三个工作溶液对于荧光探针和固定在玻璃上的DNA的杂交是很好的；与溶剂和温度不相关。一般来说，在42℃，甲酰胺基础上的杂交比65℃水溶液中的要好，因为促进了信号和杂质的比率。但在甲酰胺中的动态杂交要比在水溶液中的慢，当用低拷贝量的目标分子时，建议使用有右旋糖苷硫酸盐或聚乙烯乙二醇的水溶液。
类似的方法用于使"杂质"最小化：用Denhardt试剂，十二烷基硫酸钠（SDS）修剪鲑精DNA，tRNA和Cot1DNA。当我们用cDNA时，也包括多聚A RNA或与富含T的序列相连接的多聚A。
讨论
我们集体的努力显示了在学术环境下如何实现芯片技术的。在AECOM，芯片和扫描仪是由家庭工程师制造的，使用家庭工程师的好处是她/他是亲手改良和维修仪器的。在Pennsylvania大学，芯片是在大学机械店的帮助下在实验室中制造的；扫描仪（General扫描仪公司）是购买的。
芯片构建的改良技术必须与基因组克隆图谱实用性的增加，好的cDNA克隆，分析工具的良好使用相匹配。这些工具的综合和易操作性对基因研究发展的速度是十分重要的。