流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程

　　流行性乙型脑炎（下称乙脑）灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。用于预防乙脑。

　　1 毒种

　　1.1 毒种来源

　　P3株病毒，每3～5年应用新分离的乙脑流行株病毒检查P3株的保护力，以了解该毒株的有效性。P3株干燥毒种由中国药品生物制品检定所分发。

　　1.2 毒种检定

　　1.2.1 无菌试验

　　毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。

　　1.2.2 病毒滴定

　　每正代必须用体重7～9g小白鼠进行脑内滴定，滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用于生产。

　　1.2.3 纯毒试验

　　生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。

　　1.3毒种传代

　　分正亚代传递。从检定所取回的干燥毒种传递不超过15代称正代，由正代传递一代直接用于生产称亚代。每次用于传代的毒种不得少于3个鼠脑。

　　传代时选用体重7～9g健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，72小时后选眼结膜正常，有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，无菌取脑并进行无菌试验。

　　1.4 毒种保存

　　鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下，无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液，分装小瓶冻存于-60℃以下，无菌试验合格后备用。

　　2 疫苗制造

　　2.1 细胞制备

　　2.1.1 地鼠

　　选用健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。

　　2.1.2 细胞消化及培养

　　取肾剪碎，用适量的胰蛋白酶溶液消化。用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃进行培养。营养液中牛血清含量不得超过8%。

　　2.1.3 外源因子检查

　　每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞（4℃保存不超过7天）进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果，再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。

　　2.2 病毒接种和培育

　　挑选生长良好的细胞瓶，充分淋洗细胞后加入适量维持液，接种病毒，病毒量不得＞7.0LogLD50/1.0ml。在适当温度下培育适当时间，弃去病毒培养液，换以新维持液，继续培育一定时间。

　　疫苗生产过程中不得加青霉素或其他β内酰胺类抗生素。

　　2.3 原液

　　2.3.1 过滤

　　选择有典型细胞病变的培养瓶，经肉眼检查无菌者进行澄清过滤，细胞质量好时，可再加入新维持液，继续培育，再次收获病毒液。

　　2.3.2 病毒灭活

　　过滤后的原液，于取出无菌试验和病毒滴定样品后加入甲醛溶液，其最终浓度不得超过0.05%，置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过0.01%。

　　2.3.3 原液检定

　　2.3.3.1 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　2.3.3.2 病毒滴定

　　每个滴定批代表疫苗不得超过15万ml，将样品10倍系列稀释，取至少3个稀释度，每个稀释度用体重7～9g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判为合格，不合格者可重试一次。

　　2.4 半成品

　　2.4.1 半成品取样

　　无菌试验合格及病毒灭活到期的疫苗原液，取样做灭活试验、效力试验和无菌试验。每次解剖的地鼠制备的疫苗为一生产批，按生产批进行检定，但每批灭活试验代表疫苗量不得超过15万ml，每批效力试验代表疫苗量不得超过100万ml。无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　2.4.2 半成品检定

　　2.4.2.1 灭活试验

　　（1）动物法：将样品脑内接种体重12～14g小白鼠8只，每只　0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第一代；7天后将第一代小白鼠处死3只，取脑做成10%悬液，脑内接种6只小白鼠，为第二代；7天后将第二代小白鼠处死3只，同法接种6只小白鼠，为第三代。从接种之日起逐日观察14天，每代小白鼠除处死和接种后3日内非特异性死亡者外，全部健存为合格。

　　若传代3日后有个别小白鼠死亡，应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种3只小白鼠，观察14天，该3只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡，该批疫苗应重试，重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试，查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。

　　（2）细胞培养-动物法：将样品25ml透析24小时后，接种地鼠肾细胞或BHK21细胞，每ml样品接种不少于3cm²细胞片，置培养病毒的温度下培育14天，不得有细胞病变出现。到期的培养液脑内接种体重7～9g小白鼠10只，每只0.03ml，观察14天，应全部健存。若有死亡者应查明原因或重试，重试合格者仍可使用。不合格者应废弃。

　　以上两种灭活试验方法可任选一种。

　　2.4.2.2 效力试验

　　采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗（RA和RB）及中和试验阳性血清由中国药品生物制品检定所提供。

　　将被检苗（T）和参考苗（R）稀释成1∶32腹腔免疫体重12～14g小白鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天，第二次免疫后7天采血，分离血清，同组小白鼠血清等量混合，56℃30分钟灭活，备用。

　　稀释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清，分别与稀释好的病毒（约200PFU/0.4ml）等量混合，同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培育5天，染色，蚀斑计数，计算被检苗和参考苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间。

　　判定标准

　　（1）合格：T≥（RA+RB）/2-0.33

　　（2）重试：（RA+RB）/2-0.66＜T＜（RA+RB）/2-0.33

　　（3）不合格：T＜（RA+RB）/2-0.66

　　2.4.2.3 残余牛血清蛋白含量测定

　　用检定所认可的试剂和方法测定，残余牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。

　　3 成品检定

　　3.1 外观检查

　　疫苗应为橘红色透明液体，无异物，无沉淀。

　　3.2 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　3.3 化学检查

　　按《生物制品化学检定规程》进行。pH值为7.2～8.0。游离甲醛不高于0.05%，硫柳汞不高于0.01%。

　　3.4 安全试验

　　每批疫苗腹腔注射体重18～20g小白鼠4只，每只0.5ml，逐日观察3天，均应健存，如有小白鼠死亡，除检查原因外，应立即进行重试。

　　3.5 亚硫酸氢钠检定

　　分装后的亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的60%。无毒性试验系将样品稀释成1∶100，腹腔注射体重18～20g小白鼠2只，每只0.5ml，观察5日，应全部健存。

　　4 保存与效期

　　保存于2～8℃暗处。自效力检定合格之日起效期为2年。

　　流行性乙型脑炎灭活疫苗使用说明书

　　本品系将流行性乙型脑炎病毒接种地鼠肾细胞，培养后收获病毒液，另入甲醛溶液将病毒灭活后制成，为橘红色透明液体，含硫柳汞防腐剂，用于预防流行性乙型脑炎。

　　接种对象

　　主要为6个月～10周岁儿童和由非疫区进入疫区的儿童和成人。

　　用法

　　1.于上臂外侧三角肌附着处皮肤消毒后皮下注射。

　　2.剂量如下：

　　注：第1针与第2针间隔7～10日。为减少注射疼痛，在疫苗中可加入适量亚硫酸氢钠液，疫苗由红色变为黄色，即可注射。

　　禁忌

　　发热、急性疾病及严重慢性疾病、神经系统疾病、过敏性疾病和既往对抗生素、生物制品有过敏史者均不可注射。

　　反应

　　注射后一般无反应。个别有发热、头晕或皮疹者应注意观察，必要时给予适当治疗。

　　注意事项

　　1.疫苗混浊、变色、曾经冻结，安瓿有裂纹、有异物者均不可使用。

　　2.应备有1∶1000肾上腺素，以备偶尔发生休克时急救用。接受注射者在注射后应在现场休息片刻。

　　保存

　　应保存于2～8℃暗处。