第二十一章　淋巴细胞标志和功能的检测>

　　人体内的淋巴细胞分为T细胞、B细胞和包括NK细胞为代表的第三群细胞，下分若干亚群，各有其特异的表面标志和功能，据此建立许多相应的检测方法。临床上各种类型的免疫缺陷症、自身免疫病以及肿瘤等均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化。因此计数外周血和组织内淋巴细胞及其亚群的数目或比例，以及它们所显示的功能强弱，可藉此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制、观察病情、判断预后、考核疗效以及防治疾病等方面可提供极为有用的信息。

第一节　T细胞表面标志的检测

　　一、特异性抗原的检测

　　检测人T细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人T细胞等抗血清，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。常用以鉴定和检测计数T细胞的表面分化抗原如表21-1所示。

表21-1 T胞表面主要CD抗原及其特异性

　　用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如免疫荧光法、酶免疫法、生物素－亲和素（或链霉亲和素）系统的ABC法以及免疫金银染色法；另一类是用抗体致敏的红细胞作花环试验。两类方法各有优缺点。以下叙述有代表性的方法。

　　（一）间接免疫荧光法

　　本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应CD的单克隆抗体（如CD2、CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约200个单个核细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。

　　（二）免疫细胞化学法

　　通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。为减少非特异性着染，可选用生物素－链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄色的细胞为相应CD抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。本法简便易行，不需特殊仪器，一般试验室均可采用。

　　（三）抗体致敏细胞花环法

　　用相应的CD单克隆抗体致敏醛化的红细胞作为指示物，它与受检的细胞混匀后，置室温片刻，继经低速离心，移放室温作短期温育或4℃过夜后，重悬取样涂片染色镜检。凡受检细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞，共计数100～200个细胞，以花环形成数与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。本法需有相应的致敏红细胞试剂，受影响的因素较前两法多。

　　二、特异性受体的检测

　　T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体和T细胞抗原识别受体（TCR），其中E受体曾广泛被用作鉴定和计数T细胞的标志。当人T细胞与绵羊红细胞悬液按一定比例混匀后，置4℃至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与绵羊红细胞结合而形成玫瑰花样的花环（图21-1），取样涂片染色、镜检计数可得总花环形成北，亦即T细胞的百分率。如减少淋巴细胞与绵羊红细胞的比例，两者混合后，经短时间的温育即行取样涂片镜检计数，仍可见部分淋巴细胞形成花环，称为活性E（Ea）花环，它可能代表T细胞的一个亚群，正常值仅为总E花环的1/3～1/2，约20％～40％。检测Ea花环形成细胞比总E花环形成细胞更能反映受检者的细胞免疫水平。这类花环试验多种多样，因操作简便易行，曾被广泛使用，但影响因素较多，操作稍有不同，所得结果差异较大，因此渐被检测CD抗原方法所取代。

图21-1 显微镜下的E花环

　　有些哺乳动物与人类相似，其外周血中T细胞能与某种或某几种动物的红细胞结合形成花环，其匹配如牛、猪淋巴细胞与绵羊红细胞，狗－人、猫－豚鼠、豚鼠－兔，因此这些相应的花环试验可以作为实验研究细胞免疫有用的技术之一。T细胞抗在识别受体分α/βTCR和γ/δTCR，可用相应单克隆抗体作免疫荧光检测，现仅作为研究的工具。