第八节　诊断

　　HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和实验室检查结果而定。有不洁性交史，而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱，易复发等不难诊断。必要时可作疱液涂片，培养、接种、免疫荧光检查。血清免疫抗体测定等，均有助于诊断和确定病毒类型。

　　一、细胞学方法

　　对皮损刮片做Wright-Gemsa （Tzanck试验）或Papanicolaou染色，可检出HSV感染特征的巨细胞包函体，但不能区别HSV感染或水痘— 带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60%。

　　二、培养法

　　从水疱底部取材做组织培养分离病毒，为目前较敏感、最特异的检查方法，需5-10天，因其技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。

　　三、抗体检测

　　目前最广泛的是HSV-2抗体检测，如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体，具有敏感性，且能区分HSV-1和HSV-2的优点。

　　四、基因诊断

　　（一）用PCR分型检测单纯疱疹病毒

　　PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，标本中含有1fg HSV-DNA就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。

　　1、标本采集和处理

　　（1）标本采集

　　①脑脊液：直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色,应离心取上清。

　　②羊水及婴儿血清: 同上,应避免溶血.

　　③脑组织: 脑组织尸检、活检标本, 加1ml PBS标本缓冲液研磨后，待检。

　　④眼及皮肤病灶分泌物：用预测（半干）棉拭子直接取患处分泌物，置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　⑤生殖器（宫颈、阴道、外阴、阴茎）标本：先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　（2）标本处理

　　①预处理：所有液体标本均可直接进行模板制备；可以取100μl标本液，离心5000r/ min×5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。

　　②模板制备：a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10 min，离心5000 r/ min×5min，收集上清。 b:水煮法：沉淀物加100μl蒸馏水，摇均水煮20 min，离心5000 r/ min×5min收集上清。c:1%Triton　X-100裂解法:取采集的标本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d: 5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ min×5min收集上清。e:如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μl DW溶解待检。

　　2、PCR扩增

　　（1）引物设计。以HSV DNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物，一个上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二个下游特异性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分别扩增出HSV-1469bp DNA片段（1981～2359）、HSV-2 391bp片段（1561～1953）：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘）。

　　（2）PCR实验体系。取模板10μl： DNAP5　0.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2　0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTp 8μl(4×200μmol/L)；10×缓冲液10μl：DMSO 4μl；加DW 65.5μl；石蜡油 30μl.。

　　3．扩增产物的检测和分析

　　（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙锭（EB）染色5min，于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

　　（2）XhoI酶谱法：取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%琼脂糖凝胶中，70V电泳15～20min，可产生46bp片段带（引物后面）；与正常PCR产物比较，XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。

　　（3）Southern印迹法：PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上：80℃烤膜2 h，42℃预杂交（杂交液中）30min， 加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜；次日用1%SDS/ PBs pH7.2,　42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置X线暗盒内放射性自显影12～15h,显影为阳性, 不显影为阴性。　

　　（二）套式PCR

　　套式PCR（nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR）是通过“外侧”、“内侧”两对引物，即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物，这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性。但该方法不能分型，能100%检出HSV-1，50%检出HSV-2，应改进分型检测HSV，更好地在临床应用和基础研究中推广应用。

　　1、　标本处理：

　　（1）标本采集同上

　　（2）DNA 制备：①脑脊液：取100μlCSF 水煮15min,加入250μl无水乙醇，放-30℃10min；离心10000g30 min，去上清，30℃干燥后，加入10μl DW； ②脑组织细胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min；取上清加入等体积酚一氯仿（V/V），轻摇10 min，离心10000r/min×10 min;取水相，加入250μl DW溶解。

　　2、PCR扩增

　　(1)引物设计：选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。

NP-PCR 的引物和探针序列

　　(2) PCR实验体系和程序:　反应体积为50μl；模板10μl；BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L)； BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L)； 10×缓冲液5μl； 4×dNTp 4μl(4×200mmol/L)；DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循环20次, 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增,先95℃变性2min，循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环30次后，72℃延伸5min;。

　　(3) 扩增产物分析：

　　①　琼脂糖凝胶电泳染色法：

　　取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中， 70V电泳15-20min,溴化乙锭染色5min，于紫外灯下观察结果,在溴酚兰后面有一条，或二条亮红条带为阳性结果,HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

　　②　　 Southern印迹法：

　　PCR产物20μl 经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32P标记HSV探针后，42℃杂交过夜，次日用1%SDS/PBs pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min；膜置X线暗盒内，放射性自显影12-15h，，显影为阳性，不显影为阴性。

　　（三）、聚合酶链反应—酶谱法（polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC）

　　具有经济广泛等特点；不仅能一次性分型检测HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四种病毒，而且方法本身快速、方便、无放射线损伤，易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1，灵敏度高，能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSv DNA阳性结果，并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的变异性，会出现酶切点突变丢失现象，从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。

　　1. 标本处理

　　（1）　 标本采集，方法同上。

　　（2）　 DNA模板制备：每份标本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h；

　　加入等体积的酚—氯仿（v/v）轻摇10min，离心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA，离心15000r/min×5min,吸去液体，30℃干燥后,加蒸馏水25μl溶解,待检。

　　2. 引物设计：

　　P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

　　P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

　　（1）PCR实验体系：

　　反应体积100μl； 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ，P20.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×缓冲液10μl, DMSD 5μl, Dw 65μl, 循环参数为94℃60s; 60℃60s; 72℃60s；循环40次72℃延伸4min。

　　（2）扩增产物检测与酶切分型.

　　①第一步电泳鉴定: 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70V电泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。

　　②酶切分析：分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中，加入50μl无水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解，加入SmaI或BamHi 50U于相应Eppendorf 管内，37℃作用1h。

　　③第二步电泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液，加到2%琼脂糖凝胶中,70V电泳,15-20min后,EB染色5min,与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察,结果如下:

PCR-EC法检测四种病毒结果

　　（四）用RT-PCR检测单纯疱疹病毒

　　RNA的聚合酶链反应（RNA-PCR），可能通过检测HSV不同期的RNA，这不仅可诊断HSV感染，而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。

　　RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应（RT）产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此，RNA-PCR也可称为RT-PCR。

　　1、标本处理：

　　组织块细胞总RNA提取，取100mg组织标本，加1ml硫氰酸胍变性液，于匀浆器中，室温研磨均匀后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc, 1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀,用力振摇10s, 置冰浴15min。10000g4℃,离心20min,取上清水相(上层DNA、下层DNA和变性蛋白质)加入等体积异丙醇置-20℃1h,沉淀RNA。离心 15000r/min×10min,弃上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解,再加0.3ml异丙醇沉淀, -20℃1h, 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min,去上清, 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空干燥。.加10μl TE缓冲液（pH7.4）溶解,低温保存备用.临用前冰浴溶解。

　　2、PCR扩增:

　　（1） 引物设计: 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因.设计2个引物，

　　P1　 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′

　　P2　 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。

　　1个探针：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

　　（2）PCR实验体系：总反应体积为50μl，模板10μl （0.25-1.0μg）P1　1μl (20pmol/L)；P2 1μl (20pmol/L); 4×dNTP 4μl（200μmol/L)； 10×缓冲液5μl； AMV(逆转录酶)2μl (50U)； DW 26μl； 循环参数, 94℃变性2min后 94℃50s，60℃60,72℃60s，循环40次后72℃延伸5min。

　　3、扩增产物的鉴定：

　　（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液，混匀后加样2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15-20min，EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。

　　（2）Southern印迹杂交法：用32P标记的特异性探针检测PCR产物，方法同上。

　　总之，在HSV感染性疾病的临床诊断中，PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测，远较DNA探针敏感，并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此，PCR无论是作为基础研究手段，还是作为临床检验诊断方法，均具有广阔的前景。

　　五、病理组织学诊断

　　细胞内水肿，基底层形成大水疱，病灶周围有多核巨细胞浸润，特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间。