第六节　诊断

　　一、诊断依据：

　　（一）流行病学及临床表现

　　（二） 实验室检查

　　（1）主要是中度以上细胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴细胞耗竭：T淋巴细胞功能下降，外周血淋巴细胞显著减少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，（正常人为1.25～2.1），迟发型变态反应皮试阴性，有丝分裂原刺激反应低下。

　　（2）B淋巴细胞功能失调：多克隆性高球蛋白血症，循环免疫复合物形成和自身抗体形成。

　　（3）NK细胞活性下降

　　（4）各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤，如KS；

　　（三）HIV抗体检测

　　1.酶联免疫吸附法（ELISA）；2.明胶颗粒凝集试验（PA）；3.免疫荧光检测法（IFA）；4.免疫印迹检测法（Western Blot，简称WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。

　　（四）PCR技术检测HIV病毒

　　1．标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖（Ficoll）离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。

　　可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞（PMC）：

　　① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。

　　② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。

　　③ 2500r/min离心20min。

　　④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。

　　⑤ 加入RPMI-1640生长液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/ml polyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P）,使细胞浓度为2×106/ml。

　　⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。

　　2．模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。

　　（1）从外周血单核细胞中提取DNA

　　方法A：

　　①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。

　　②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。

　　③2500r/min离心10min，弃上清。

　　④沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使细胞浓度为6×106/ml。

　　⑤加入等体积的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/l MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。

　　⑥　于37℃保湿后置冰箱保存。

　　该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。

　　方法B：

　　①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。

　　②2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。

　　③用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖）将沉淀的细胞洗一次。

　　④再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗两次。

　　⑤通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。

　　⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液（10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使细胞裂解。

　　⑦用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。

　　⑧加入3倍体积的无水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。

　　该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。

　　（2）从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录

　　方法A：

　　① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。

　　② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。

　　③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。

　　④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液（0.4mmol/L NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使细胞浓度为104/ml。

　　⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。

　　⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。

　　在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如（7）～（9）。

　　⑦ 取10μlRNA样品加2.7U DNase I。

　　⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。

　　⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase A（15μg/份），37℃保温10min，置-20℃保存。

　　方法B：

　　①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。

　　②40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。

　　③将沉淀物溶于变性液（4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇）中充分混匀.

　　④加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.

　　⑤13000r/min离心20min.

　　⑥轻轻将水相转移到一支新管中.

　　⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右.

　　⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀.

　　⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥.

　　⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录.

　　⑾ 取10μl RNA样品.

　　⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH 8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHH　　TR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。

　　⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min.

　　⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。

　　由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。

　　三、PCR扩增步骤

　　（一）引物的设计与合成

　　HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。

　　检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。

　　已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。

表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及探针

　　（二）PCR扩增步骤

　　1．扩增条件

　　当选择的引物影响其特异性和扩增效果时，首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度，PCR循环数，反应物浓度等。扩增的条件通常是1～4mmol/LMgCl2，0.5～1.0mmol/l dNTP,每100μl反应体积2～4U Taq DNA聚合酶,2μgBSA,10pg靶DNA,扩增25～30循环,退火温度为37℃,引物浓度6μg/ml。在37～55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度.尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异,但它们的原理都是相似的。

　　2.扩增的步骤

　　(1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA样品。

　　(2)用10μl 1×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl pH8.8,500mmol/l KCl，2mmol/L MgCl₂,16mmol/L DTT)。

　　(3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。

　　(4)反应混合物于93℃变性处理7min。

　　(5)冷却至室温,加入4U TaqDNA聚合酶,反应最终体积为100μl。

　　(6)加入50μl矿物油,离心10s。

　　(7)置70℃保温5min。

　　(8)PCR扩增25个循环,95℃1 min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。

　　PCR检测出现假阴性的原因有：标本中的HIV-DNA量极少，未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平；DNA模板和PCR产物未能完全变性，使得引物不能或较少与DNA片段结合，从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异，也会出现假阴性。PCR假阳性的原因主要有：标本的交叉污染；重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照，阴性对照用无HIV-DNA标本的反应混合液，阳性对照用已知的HIV-DNA。

　　四、扩增产物的检测和分析

　　扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳，限制性内切酶图谱，DNA序列分析及分子杂交等技术。

　　（一）凝胶电泳分析

　　根据所采用的引物对之间DNA片段的长度，预计PCR产物的分子大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较，可初步判断PCR产物的特异性，然后将产物用限制性内切酶水解，进一步确定扩增产物的特异性。

　　（二）分子杂交分析

　　分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法，也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交，检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下：

　　PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。

　　PCR技术检测HIV具有敏感性高，特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV-1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB染色的电泳凝胶来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0.05感染细胞的RNA量(相当于5个感染H9细胞的HIV-1-RNA/5×106个未感染细胞)。

　　四、PCR技术在HIV检测中的应用

　　PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列，这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性；可用来监测长潜伏期（4～7年）病人，以及在抗病毒治疗期间病毒的水平；也可用于HIV-1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初的6～9个月期间，他们的血液中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。

　　（一）血清抗体阳性病人HIV序列的检测

　　有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞培养物，精液细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV-1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI消化。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明，在逆转录酶阴性的28个细胞系中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多细胞培养物认为是阴性者，实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。

　　从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA，用PCR可100%检出病毒序列；用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本，经PCR扩增检出病毒序列者为64%，血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性，表明未出现假阳性结果。由于HIV-1基因组的广泛的异源性，为提高检测的阳性率可采用多种引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性（99%）。

　　(二)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测

　　由于在感染HIV后到出现免疫反应之前有一段滞后期,这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月,而且无抗体产生期可能更长些.在此期间受感染者往往检测不到抗体,因此,血清阴性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月.对少数初次共培养呈阴性的人,甚至可在血清转阳之前24～39个月就能确诊为HIV-1感染.对血清学试验结果不能确定者,也可通过PCR作进一步分析和确诊。

　　(三)新生儿HIV序列的检测

　　HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在,用抗体检测法通常为阳性.但实际上只有20%～60%的婴儿受到HIV感染.因此,对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的.现已证明30～50%的这些新生儿可在母亲的子宫里,在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV.新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染.因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久.在一般情况下,婴儿并不表现出HIV感染的任何症状.病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法;HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的;在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也是十分困难的.另外,婴幼儿被HIV感染后病情发展较快.早期诊断,对及时采取治疗措施,延缓阻止病情发展极为重要.目前所使用的抗病毒药毒性大,因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿.但当用PCR检测出HIV-DNA序列后,即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗.在一项研究中,14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性;在出生后12～15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性.从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中,收集的外周血单核细胞经PCR检测,7个为阳性的婴儿,其中5个在检测后10个月得AIDS;而PCR阴性的9个婴儿,在16个月的追踪检查期间身体状况良好.这些研究表明,PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的.

　　PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用.但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者。PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV。

　　二、艾滋病诊断标准：

　　1．艾滋病病毒抗体阳性，又具有下述任何一项者，可为实验确诊艾滋病病人。

　　（1）近期内（3-6个月）体重减轻10%以上，且持续发热达38℃一个月以上；

　　（2）近期内（3-6个月）体重减轻10%以上，且持续腹泻（每日达3-5次）一个月以上。

　　（3）卡氏肺囊虫肺炎（PCR）

　　（4）卡波济肉瘤KS。

　　（5）明显的霉菌或其他条件致病感染。

　　2．若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时，可为实验确诊艾滋病病人。

　　（1）CD4/CD8（辅助/抑制）淋巴细胞计数比值<1，CD4细胞计数下降；

　　（2）全身淋巴结肿大；

　　（3）明显的中枢神经系统占位性病变的症状和体征，出现痴呆，辩别能力丧失，或运动神经功能障碍。