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第三节 动脉血管壁细胞间质成分的提取

  一、胶原的提取

  动脉血管壁胶原提取的基本方法是,首先除去凝血等其他杂质,由于胶原为杆状三螺旋结构,能耐受胃蛋白酶的作用,但是两端球蛋白结构能被胃蛋白酶水解。胶原纤维内分子间的共价交联是由分子末端赖氨酸或羟赖氨酸形成,用胃蛋白酶切断末端交联结构,使胶原分子的巨形结构被破坏,从完整分子可提出各种类型的胶原。

  (一)胶原的初步分离

  1.小心取出动脉血管,用0.05mol/L BPS pH7.8洗净凝血块,3kr/min离心10min。

  2.冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪,蒸馏水洗涤3次。

  3.将组织破碎,加三倍体积组织匀浆处理液(0.5mol/L乙酸,pH2.5,1%胃蛋白酶)于4℃48h,16kr/min离心45min,同样方法重复3次。

  4.向留取的上清液中缓缓加入NaCl,最终达到4mol/L浓度,搅拌12~24h,15kr/min离心45min,弃上清。

  5.进一步分离各种胶原可用分段盐析和柱层析法进行操作。

  (二)胶原的分段盐析

  1.取初级提取物加0.1mmol/L乙酸,加NaCl至0.7mmol/L,15kr/min离心20min。沉淀提取Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原,上清提取Ⅳ、Ⅴ型胶原。

  2.沉淀,加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保湿16h,10kr/min离心20min,上清液加NaCl至4mol/L,离心,沉淀物为Ⅳ型胶原。

  3.1mol/L NaCl溶解沉淀,加3倍体积Tris-HCl pH7.4,10kr/min离心20min,沉淀为Ⅲ型胶原。

  4.上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min离心20min,沉淀为Ⅰ胶原。

  5.取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min离心20min。

  6.沉淀溶于4倍体积1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4,加NaCl至4mol/L 10kr/min离心20min。

  7.上清加NaCl至4mol/L,调pH到3.5,离心得沉淀再加5倍体积0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液悬浮16h,小心取上清加NaCl至4mol/L,10kr/min离心10min,沉淀为Ⅳ型胶原。

  8.将6.沉淀部分加0.2mol/L NaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE悬浮16h,上清加NaCl至4mol/l,10kr/min离心10min,沉淀为Ⅴ型胶原。

  (三)将初步提取的胶原加到DEAE纤维柱上,用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脱,230nm波长检测洗脱物。因为胶原在pH7.5时均带正电荷,不与DEAE柱结合,所以被柱结合的则为非胶原蛋白。

  二、蛋白多糖的提取

  蛋白多糖具有可溶于4mol/L盐酸胍的性质,再经DEAE-纤维素层析除去其他杂质,非蛋白多糖与蛋白多糖用不同浓度尿素可分段层析分开。

  1.取动脉血管小心除去血管周围脂肪组织和纤维膜,用冷0.5mol/l PBS pH7.8洗涤,2kr/min离心10min。

  2.用匀浆器破碎,加入15倍体积的提取液(0.05mol/L乙酸pH5.8、4.0mol/L盐酸胍、0.1mol/l 6-氨基乙酸EDTA、3mol/L苄脒),于4℃缓慢振荡24h,10kr/min离心30min。

  3.取上清透析浓缩30倍。

  4.将提取液加入已经平衡好的DEAE-纤维素柱上,分别用0.15mol/l NaCl和2mol/LNaCl洗脱,均用280nm波长紫外监测仪连续监测。

  三、弹性蛋白的提取

  提取方法较多,各有优缺点。1969年Bornstein和Ross先用5mol/L盐酸胍抽提,再用胶原酶水解其他非弹性蛋白组分,最后还原二硫键,分离提取弹性蛋白。具体方法如下:

  1.将动脉血管壁洗净,小心除去附着结缔组织。

  2.将血管壁组织浸于4℃ 50%的吡啶液,破碎组织,3kr/min离心15min。

  3.取沉淀用蒸馏水洗涤3次,真空干燥后研成粉末。

  4.将粉末悬浮于2mol/L NaCl,4℃搅拌24h,3kr/min离心20min,弃上清,沉淀用蒸馏水洗3次。

  5.将沉淀用无水乙醇脱脂20min,用氯仿-甲醇(2:1)处理20min,再用乙醚冲洗干燥,3kr/min离心20min,真空干燥沉渣。

  6.干燥的沉淀物用5倍处理液(0.5mol/L CaCl2、10.05mol/l Tris-HClpH7.5、2%胶原酶)洗涤,3kr/min离心20min。

  7.将沉淀移入带塞的瓶中,加含0.5mol/L盐酸胍、0.1mol/l Tris-HClpH8.5、0.05mol/L二硫赤藓糖醇,2.0mol/L EDTA液4℃过夜。

  8.3kr/min离心20min,沉淀用蒸馏水洗涤2次。

  9,沉淀物加入处理液(6mol/L尿素、0.1%SDS、0.05mol/L二硫赤藓糖醇、0.05mol/l Tris-HCl pH7.7),通过氮氧真空过夜,3kr/min离心20min。

  10.沉淀再真空干燥,即为弹性蛋白。

  四、粘连蛋白的提取

  提取粘连蛋白的基本原理是用NaCl脱氧胆酸钠液提取血管壁中的粘连蛋白,再用高盐除去杂质,然后进一步用Sephacryl层析纯化,方法如下:

  1.将动脉血管壁组织加10倍体积处理液(0.05mol/l Tris-HCL pH7.6、0.5%核酸酶),4℃搅拌20min,10kr/min离心10min。

  2.沉淀用含0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、10%甲醇液,洗涤2次,10kr/min离心10min。

  3.沉淀物中,加40倍体积处理液(0.05mol/l Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/L NaCl,)4℃过夜后,10kr/min离心10min。

  4.上清用PEG6000浓缩,最后加入已平衡好的Sephacryl S-3000层析柱上,用0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%NaCl洗脱,第一峰即为粘连蛋白。