第四节　免疫火箭电泳法

　　一、原理

　　定量的抗原加入到含有一定量的相应抗体的琼脂糖凝胶中，在电场作用下，引起抗原抗体的迁移和相互反应，当比例合适时形成肉眼可见的沉淀峰，由于电泳继续进行，样品孔不断有抗原移向抗原抗体复合物的沉淀峰，因抗原过剩使沉淀溶解而在前面又形成新的抗原抗体复合物的沉淀峰。如此反复向前，直到再无游离抗原而反应终止，形成上行火箭状的沉淀峰，其沉淀峰高度和抗原的浓度成正比，与同样条件下的已知浓度的抗原血清比较，即可求得待测血清的抗原含量。

　　二、试剂（以ApoB为例）

　　1．琼脂糖。

　　2．巴比妥钠缓冲液（μ=0.05，pH=8.6）:巴比妥钠10.30g，巴比妥1.84g、甘氨荎1.0g、PEg 60004g，加900ml水加温助溶，待冷，加1mol/L调pH至8.6，混匀，转入1000ml容量瓶内，再加水到刻度，测试pH后装瓶待用。

　　3．羊抗人ApoB血清（效价1：128以上）

　　4．ApoB标准血清。

　　5．固定液：1%鞣酸或10%三氯醋酸。

　　6．氨基黑10B染色液：氨基黑10B0.1g，溶于100ml甲醇-醋-水溶液（7：1：2）。

　　三、操作

　　1．用巴比妥钠缓冲液配制1.5%琼脂糖液，在水浴煮溶，置56℃水箱备用。

　　2．取巴比妥钠缓冲液3.36ml入小三角烧瓶内，再加抗人ApoB抗血清0.04ml，充分混和，预温至56℃。

　　3．在预温至56℃的3.4ml抗血清缓冲液内，加入1.5%琼脂糖3.5ml，混匀，立即倒入预封好的有机玻璃架内，待凝。

　　4．用打孔器按图打孔，孔径3mm。孔距3mm。

　　5．置凝胶板于水平电泳槽内，两极用三层滤纸搭桥，抗原一端接阴极，另一端接阳极。

　　6．以电压12V/cm通电，用微量进样器准确加入等测血清5μl（1：20或1：30稀释）。

　　电泳2～3h后，关闭电源，置凝胶板于10.0%三氯醋酸液固定15～20min，取出胶板，在黑色背景灯光下量取沉淀峰高度，如图18-3所示。

图18-3 免疫火箭琼脂糖电泳图

　　7．计算

　　（1）查标准曲线。

　　（2）按下式计算：

　　8．如果需要也可将凝胶板置0.9% NaCl液漂洗过夜更换蒸馏水漂洗，底板衬以硬薄膜，尔后置染色液染色，脱色后可见明显的沉淀峰，干燥，以便长期保存。