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第二节 甘油三酯测定

  甘油三酯又称中性脂肪,由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸,相应称为甘油三酯(TG)、甘油二酯(DG)和甘油一酯(MG)。血清中90%~95%是TG,TG中结合的脂肪酸分别为油酸(44%)、软脂酸(26%)、亚油酸(16%)和棕榈油酸(7%)。

  血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。

  血清中TG的化学组成并不单一,准确求其分子较为困难。因标准不同,测定结果存在差异。化学法多采用三棕榈精(软脂精)(分子量807.3)、三油精(分子量895.4)为标准,按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。

  1.化学法

  化学测定法包括:①TG的抽提分离;②皂化;③甘油糖的氧化;④氧化生成甲掌显色定量等四个阶段。操作较为繁杂,影响测定因素太多,本法准确性差,一般很少用。

  2.酶法测定

  酶法测定包括:①TG的抽提与皂化;②加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。目前常规检测应用的方法有甘油激酶(glycerol kinase,GK)法和甘油氧化酶(glycerol Oxidase,GOD)法。操作简便,快速准确,并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。

  一、乙酰丙酮法

  1.原理

  血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯,经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸,甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛,在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的3,5二乙酰,1,4二氢甲基吡啶,其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比,420nm测定定量。该法可用于基本功训练及组织细胞TG的提取测定。

  2.试剂组成

代号 种类 浓度 组成 贮2-8℃ 有效时间
R1 抽提液 (CH3)CHOH(A.R)重蒸馏
R2 吸附剂   氧化铝,水洗除去微细颗粒,
110℃烤干3h以上
闭封 一周
R3 皂化剂 5% KOH 5g+H2O→100ml    
R4 醋酸溶液 2mol/L CH3COOH 11.5ml+H2O→100ml    
R5 过碘酸钠 0.05mol/L NaIO4 1.07g+H2O→100ml    
R6 氧化剂   R4 1体积+R51体积   一周
R7 醋酸铵液   CH3COONH2 15.4g+H2O→100ml    
R8 显色剂 CH3COCH2COCH30.75ml+R-1
40ml+R-7 100ml+R-4 80ml
R9 参考液 2mg/dl 三油酸甘油酯

2mg+R-1→100ml(TG100mg/dl)

  3.操作

  按图15-3操作。

图15-3 血清甘油三酯(乙酯丙酮法)测定操作图

  4.计算

  血清TG浓度=ESA/EST×1.13(mmol/L)

  二、酶法(GK-GPO-POD比色法)

  血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸,甘油在甘油激酶(GK)及ATP存在下,生成3-磷酸甘油,尔后,在磷酸甘油氧化酶(GPO)作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成H2O2,H2O2与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶(POD)作用下,生成红色亚醌化合物(quinoneimine),比色(500nm),其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。

  (一)手工测定法

  1.试剂组成

代号 种类 浓度 贮存2~8℃
R1 磷酸甘油氧化酶 ≥3.0KU/L 冷藏
(A液) 抗坏血酸氧化酶 ≥1.0KU/L  
甘油激酶 ≥0.7KU/L  
4-氨基安替比林 80mg/L  
R2 脂蛋白脂酶 ≥2.0KU/L 冷藏
过氧化物酶 ≥10KU/L  
ESPAS 300mg/L  
R3(参考液) 甘油酸三脂 200mg/dl(2.26mmol/L) 冷藏

  *:一般采用商品试剂盒

图15-4 血清甘油三酯测定法(酶法)操作图

  2.操作

  按图15-4操作。

  3.计算

  血清TG浓度=ESA/EST×2.26(mmol/L)

  (二)生化分析仪检测

  全自动生化分析仪测定操作(以CL-7200型为例)。

  1.试剂

  A液:GK,GPO,4-AA-P、抗坏血酸氧化酶等。

  B液:POD,Lipase,ESPAS等。 

  标准液:甘油三油酸酯 200mg/dl(2.26mmol/L)。

  2.上机参数

名称 参数
方法 终点法
波长 双波长(540nm 700nm)
试剂A反应时间 2~3min
试剂B反应时间 5~6min
反应温度 37℃
样本用量 4μl
试剂A用量 200μl
试剂B用量 100μl
单位 mmol/L

  3.操作过程

  4.计算

  以△A=A2-A1并根据同样之标准或质控物计算,自动打印结果。

  5.注意事项

  ①试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

  ②试剂在有效期内2~8℃避光保存。

  ③样本中甘油三酯含量超过11mmol/L需用生理盐水稀释后再测。