第二节　外界因素对细菌的影响

　　细菌在自然界必然不断经受周围环境中各种因素的影响。当环境适宜时，细菌能进行正常的新陈代谢而生长繁殖；若环境条件变化，可引起细菌的代谢和其他性状发生变异；若环境条件改变剧烈，可使细菌生长受到抑制或导致死亡。因此掌握微生物对周围环境的依赖关系，在医疗实践中，一方面可创造有利条件，促进微生物的生长繁殖，从病理材料中分离培养病原微生物，有助于传染病的诊断以及制备疫苗，来预防某些传染病；另一方面，也可利用环境对细菌不利因素，抑制或杀灭病原微生物，以达到消毒灭菌的目的。本节重点介绍外界环境对细菌不利因素，提高对消毒灭菌的认识以便在实际工作中加以应用。

　　消毒（Disinfection）杀灭病原微生物的方法。用以消毒的药物称为消毒剂(Disinfectants)一般消毒剂在常用浓度下，只对细菌繁殖体有效。对于芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间。

　　灭菌（Sterilization）杀灭物体上所有的微生物（包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞）的方法。因此，灭菌比消毒的要求高；但在日常生活中，消毒和灭菌这两个术语往往通用。

　　无菌（Asepsis）物体上或容器内无活菌存在的意思。无菌操作是防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。例如，进行外科手术或微生物学实验时，须注意无菌操作。

　　防腐（Antisepsis）防止或抑制微生物生长繁殖的方法。用于防腐的化学药物称为防腐剂。许多药物在低浓度时只有　抑菌作用，浓度增高或延长作用时间，则有杀菌作用。

　　消毒与灭菌技术的选择，取决于多种因素。在实际工作中应根据消毒灭菌的对象和目的要求不同，以及条件的不同，选择不同的合适方法。

　　一、物理因素

　　各种物理因素对细菌都能产生一定的影响作用。

　　（一）热力灭菌

　　高温对细菌有明显的致死作用。热力灭菌主要是利用高温使菌体变性或凝固，酶失去活性，而使细菌死亡。但是，更细微的变化已发生于细菌凝固之前。有人认为DNA单螺旋的断裂可能是主要的致死因素。细菌蛋白质、核酸等化学结构是由氢键连接的，而氢键是较弱的化学键，当菌体受热时，氢键遭到破坏，蛋白质、核酸、酶等结构也随之被破坏，失去其生物学活性，与细菌致死有关。此外，高温亦可导致胞膜功能损伤而使小分子物质以及降解的核糖体漏出。干热的致死作用与湿热不尽相同，一般属于蛋白变性、氧化作用受损和电解质水平增高的毒力效应。

　　热力灭菌时最可靠而普遍应用的灭菌法，包括湿热灭菌和干热灭菌法。

　　1．湿热灭菌法

　　 在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有：①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，因较大同一温度的干热空气中易于凝固。②温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度。因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。

　　湿热灭菌法包括有：

　　（1）煮沸法：煮沸100℃，5分钟，能杀死一般细菌的繁殖体。许多芽胞需经煮潮5～6小时才死亡。水中加入2%碳酸钠，可提高其沸点达105℃。既可促进芽胞的杀灭，又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。

　　（2）流通蒸汽灭菌法：利用100℃左右的水蒸汽进行消毒，一般采用流通蒸汽灭菌器（其原理相当于我国的蒸笼），加热15到39分钟，可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、过紧以利于蒸汽穿透。

　　（3）间歇灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽，以达到灭菌的目的。一般用流通蒸汽灭菌器，100℃加热15～30分钟，可杀死其中的繁殖体；但芽胞尚有残存。取出后放37℃孵箱过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再蒸一次，如此连续三次以上。本法适用于不耐高温的营养物（如血清培养基）的灭菌。

　　（4）巴氏消毒法（Pasteurization）：利用热力杀死液体中的病原菌或一般的杂菌，同时不致严重损害其质量的消耗方法。由巴斯德创用以消毒酒精类，故名。加温61.1～62.8℃半小时，或71.7℃15～30秒钟。常用于消毒牛奶和酒类等。

　　（5）高压蒸汽灭菌法：压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。

　　目前使用的压力灭菌器可分为两类：下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器。适用于耐高温、耐水物品的灭菌。

　　2．干热灭菌法

　　干热灭菌比湿热灭菌需要更高的温度与较长的时间。

　　（1）干烤：利用干烤箱，加热160～180℃2小时，可杀死一切微生物，包括芽胞菌。主要用于玻璃器皿、瓷器等的灭菌。

　　（2）烧灼和焚烧：烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。焚烧是彻底的消毒方法，但只限于处理废弃的污染物品，如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚烧应在专用的焚烧炉内进行。

　　(3) 红外线：红外线辐射是一种0.77～1000微米波长的电磁波,有较好的热效应,尤以1～10微米波长的热效应最强。亦被认为一种干热灭菌。红外线由红外线灯泡产生,不需要经空气传导，所以加热速度快，但热效应只能在照射到的表面产生，因此不能使一个物体的前后左右均匀加热。红外线的杀菌作用与干热相似，利用红外线烤箱灭菌的所需温度和时间亦同于干烤。多用于医疗器械的灭菌。

　　人受红外线照射较长会感觉眼睛疲劳及头疼；长期照射会造成眼内损伤。因此，工作人至少应戴能防红外线伤害的防护镜。

　　（4）微波：微波是一种波长为1毫米到1米左右的电磁波，频率较高，可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。微波能使介质内杂乱无章的极性分子在微波场的作用下，按波的频率往返运动，互相冲撞和磨擦而产生热，介质的温度可随之升高，因而在较低的温度下能起到消毒作用。一般认为其杀菌机理除热效应以外，还有电磁共振效应，场致力效应等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ与915MHZ两种。微波照射多用于食品加工。在医院中可用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品食具、药杯及其它用品的消毒。

　　微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应，因此必须关好门后才开始操作。

　　（二）电磁波与射线

　　1．日光与紫与外

　　日光是有效的天然杀菌法，对大多数微生物均有损害作用，直射杀菌效果尤佳，其主要的作用因素为紫外线，此外，热与氧气起辅助作用。但光线效应受很多因素的影响，如烟尘笼罩的空气、玻璃及有机物等都能减弱日光的杀菌力。

　　紫外线是一种低能量的电磁辐射，波长范围为240～280nm,最适的波长为260nm，这与DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体，从而干拢DNA的复制，导致细菌死亡或变异。紫外线的穿透能力弱，不能通过普通玻璃、尘埃，只能用于消毒物体表面及空气、手术室、无菌操作实验室及烧伤病房，亦可用于不耐热物品表面消毒。杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛均有损伤作用，使用时应注意防护。

　　2．电离辐射

　　包括高速电子、X线和r线等。具有较高的能量与穿透力，可在常温下对不耐热的物品灭菌，故又称“冷灭菌”。其机理在于产生游离基，破坏DNA。可用于消毒不耐热的塑料注射器和导管等；亦能用于食品消毒而不破坏其营养成份。

　　（三）滤过除菌法

　　将液体或空气通过含有微细小孔的滤器，只允许小于孔径的物体如液体和空气通过，大于孔径的的物体不能通过。主要用于一些不耐热的血清、毒素、抗生素、药液、空气等除菌。一般不能除去病毒、支原体和细菌的L型。滤器的种类很多常用的有：

　　滤膜滤器（Membrane filter）由硝基纤维素制成薄膜，装于滤器上，其孔径大小不一，常用于除菌的为0.22um。硝基纤维素的优点是本身不带电荷，故当液体滤过后，其中有效成分丧失较少。

　　蔡氏滤器（Seitz）是用金属制成，中间夹石棉滤板，按石棉K、EK、EK-S三种，常用EK号除菌。

　　玻璃滤器是用玻璃细砂加热压成小碟，嵌于玻璃漏斗中一般为G1、G2、G3、G4、G5、G6六种，G5、G6可阻止细菌通过。

　　实验室等处应用的超净工作台，就是利用过滤除菌的原理去除进入工作台空气中的细菌。

　　（四）超声与超声波（Ultrasonic and sonic waves）

　　每秒钟超过200，000次振动的声波不被人耳感受，称为超声波。微生物对强度高的超声波很敏感。其中以革兰氏阴性菌最敏感，而葡萄球抵抗最强。虽然声波强烈地振动可使菌群死亡，但往往有残存者。因此，这种方法在消毒灭菌方面无实用价值。主要用以裂解细胞分离提取细胞组分或制备抗原。超声波灭菌的机理尚不清楚，可能是细菌外表受细微气泡的作用，扰乱细胞内容物及破坏细胞壁致细菌崩解而死亡。

　　（五）干燥

　　多数细菌的繁殖体在空气中干燥时很快死亡，例如脑膜炎双球菌、淋球菌、霍乱弧菌、梅毒螺旋体等。有些细菌抗干燥力较强，尤其有蛋白质等物质保护时。例如溶血性链球菌在尘埃中存活25日，结核杆菌在干痰中数月不死。芽胞抵抗力更强，例如炭疽杆菌耐干燥20余年。干燥法常用于保存食物。浓盐或糖渍食品，可使细菌体内水分逸出，造成生理性干燥，使细菌的生命活动停止。

　　（六）低温

　　多数细菌耐低温。在低温状态下，这些细菌的代谢减慢，当温度如回升到适宜范围又能恢复生长繁殖，故低温常用作保存菌种。

　　二、化学因素

　　化学药物能影响细菌的化学组成、物理结构和生理活动，从而发挥防腐，消毒，甚至灭菌的作用。防腐剂的浓度高或作用时间长，也可达到消毒的目的。消毒及防腐药物对人体组织有害，只能外用或用于环境消毒。

　　（一）化学消毒剂

　　1．化学消毒剂的种类

　　化学消毒剂的种类很多，其杀菌作用亦不尽相同。一般可根据用途与消毒剂的特点选择使用（见表4-2）

表4-2 消毒剂种类、性质与用途

　　2．化学消毒剂的作用机制

　　不同的化学消毒剂其作用原理也不完全相同，大致归纳为三个方面。一种化学消毒剂对细菌的影响常以其中一方面为主，兼有其他方面的作用。

　　（1）改变细胞膜通透性 表面活性剂（Surface-active agent）、酚类及醇类可导致胞浆膜结构紊乱并干扰其正常功能。使小分子代谢物质溢出胞外，影响细胞传递活性和能量代谢。甚至引起细胞破裂。

　　（2）蛋白变性或凝固酸、碱和醇类等有机溶剂可改变蛋白构型而拢乱多肽链的折叠方式，造成蛋白变性。如乙醇、大多数重金属盐、氧化剂、醛类、染料和酸碱等。

　　（3）改变蛋白与核酸功能基团的因子作用于细菌胞内酶的功能基（如SH基）而改变或抑制其活性。如某些氧化剂和重金属盐类能与细菌的-SH基结合并使之失去活性。

　　3．影响消毒剂作用的因素

　　（1）消毒剂的性质、浓度与作用时间各种消毒剂的理化性质不同，对微生物的作用大小也差异。例如表面活性剂对革兰氏阳性菌的灭菌效果比对革兰氏阴性菌好，龙胆紫对葡萄球菌的效果特别强。

　　同一种消毒剂的浓度不同，其消毒效果也不一样。大多数消毒剂在高浓度时起杀菌作用，低浓度时则只有抑菌作用。在一定浓度下，消毒剂对某种细菌的作用时间越长，其效果也越强。若温度升高，则化学物质的活化分子增多，分子运动速度增加使化学反应加速，消毒所需要的时间可以缩短。

　　（2）微生物的污染程度微生物污染程度越严重，消毒就越困难，因为微生物彼此重叠，加强了机械保护作用。所以在处理污染严重的物品时，必须加大消毒剂浓度，或延长消毒作用的时间。

　　（3）微生物的种类和生活状态不同的细菌对消毒剂的抵抗力不同，细菌芽胞的抵抗力最强，幼龄菌比老龄菌敏感。

　　（4）环境因素当细菌和有机物特别是蛋白质混在一起时，某些消毒剂的杀菌效果可受到明显影响。因此在消毒皮肤及器械前应先清洁再消毒。

　　（5）温度、湿度、酸碱度消毒速度一般随温度的升高而加快，所以温度越高消毒效果越好。湿度对许多气体消毒剂有影响。酸碱度的变化可影响剂杀灭微生物的作用。例如，季胺盐类化合物的戊二醛药物在碱性环境中杀灭微生物效果较好；酚类和次氯酸盐药剂则在酸性条件下杀灭微生物的作用较强。

　　（6）化学拮抗物阴离子表面活性剂可降低季胺盐类和洗比泰的消毒作用，因此不能将新洁尔灭等消毒剂与肥皂、阴离子洗涤剂合用。次氯酸盐和过氧乙酸会被硫代硫酸钠中和，金属离子的存在对消毒效果也有一定影响，可降低或增加消毒作用。

　　（二）防腐剂

　　用于防腐的药物称为防腐剂。生物制剂（如疫苗、类毒素、抗毒素等）中常加入防腐剂，以防止杂菌生长。常用防腐剂有0.5%石炭酸、0.01%硫柳汞和0.1～0.2%甲醛等。

　　（三）化学疗剂

　　用于治疗由微生物或寄生虫所引起疾病的化学药物，称为化学治疗剂，化学治疗剂具有选择性毒性作用，能在体内抑制微生物的生长繁殖或使其死亡，对人体细胞一般毒性较小，可以口服、注射。化学治疗剂的种类很多，常用的有磺胺类、呋喃类和异烟肼等。

　　三、生物因素的影响

　　（一）噬菌体（Bacteriophage）

　　噬菌体是能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体的病毒。噬菌体分布广泛，凡是有细菌存在的场所，就可能有相应噬菌体的存在。噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居于易感宿主菌体内。

　　在电镜下噬菌体有三种外形，蝌蚪形、微球形和线形。大多数噬菌体呈蜊蚪形，由头部和尾部两部分组成（图4-1）。但也有无尾的噬菌体。较大的噬菌体头部的形状常为六棱柱体，头部含有核酸，外围绕一层蛋白质外壳。少数噬菌体还具有包膜。噬菌体的尾部为噬菌体与细菌接触的器官。不同的噬菌体尾部结构差异很大。噬菌体的化学成份仅含蛋白质及一种核酸，大部分噬菌体的核酸是DNA。噬菌体对理化因素的抵抗力较强。

图4-1 大肠杆菌T2噬菌体结构模式图

　　1．噬菌体和宿主菌细胞的关系

　　噬菌体感染细菌时，先通过尾刺或尾丝等特异地吸附到敏感细菌表面相应受体上，当噬菌体的尾插入细菌体时，借助于尾部含有的一种溶菌酶类物质，将胞壁溶一小孔使尾鞘插入，噬菌体的核酸很快从尾部注入细菌细胞，而致细菌发生感染。细菌感染后可出现菌体裂解或形成溶源性细菌两种结果（图4-2）。

图4-2 噬菌体与细菌的相互作用（噬菌体-宿主生活周期）示意图

　　噬菌体核酸进入细胞浆后，宿主细胞即停止合成细菌自身的DNA，转而按噬菌体DNA所提供的遗传信息合成新的蛋白质，包括一些合成噬菌体DNA所需的酶及噬菌体头、尾部蛋白质亚单位等。当噬菌体DNA和蛋白质分别合成以后，在细菌胞浆内装配成为完整的成熟噬菌全。当它们增殖到一定程度，菌细胞发生裂解，释放出游离的噬菌体。噬菌体进入细菌细胞后，能在敏感宿主菌内复制增殖并使之裂解的噬菌体称为毒性噬菌体（Virulent phage）。

　　有些噬菌体不在敏感细菌内增殖，其基因整合于细菌基因组中，成为细菌DNA的一部分，当细菌分裂时，噬菌体的基因亦随着分布至两个子代细菌的基因中。这种噬菌体称为溶源性噬菌体（Lysogenic phage）或温和噬菌体(Temperat phage)。整合在细菌DNA上的噬菌体基因称为前噬菌体(Prophage)，带有前噬菌体的细菌称为溶源性细菌(Lysogeneic bacteria)。

　　溶源性噬菌体能正常繁殖，但这种带噬菌体的溶源状态有时能自发终止，结果导致噬菌体增殖而引起细菌裂解。用紫外线照射或过氧化氢等处理溶源性细菌，可诱导前噬菌体从细菌的DNA分开，而开始其溶菌性周期。偶尔溶源性细菌也可失去前噬菌体。

　　2．噬菌体在医学和生物学中的应用

　　（1）细菌的鉴定与分型噬菌体的作用具有高度特异性。一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌，故可用于细菌的鉴定和分型。目前已利用噬菌体将金黄色葡萄球菌分为四个群数百个型，这种用噬菌体分型的方法，在流行病学调查上，对追查和分析这些细菌性感染的传染源很有帮助。

　　（2）检测标本中的细菌应用噬菌体效价增长试验检查标本中的相应细菌，若在检材中检出某种噬菌体时，常提示有相应细菌存在。

　　（3）分子生物学研究的重要工具噬菌体基因数量少，有些噬菌体为某种遗传基因缺陷株，有些噬菌体经人工诱导的变异和遗传容易控制和辩认，并且可用于基因的转导和变换等研究。近年来，噬菌体已成为遗传研究中的主要的基因载体工具。

　　（二）抗生素（Antibiotic）

　　某些微生物在代谢过程中产生的，能抑制或杀灭其他微生物的一种化学物质。抗生素主要来源于放线菌、某些真菌和细菌。目前生产的抗生素，除从微生物培养液中提取外，有些已能人工合成或半合成。

　　抗生素的作用主要干扰病原微生物的代谢过程，从而起到抑菌或杀菌作用。抗生素的作用原理大体可概括以下方式：（1）抑制细菌细胞壁的合成（如青霉素）；（2）影响细菌细胞膜的通透性（如多粘菌素）；（3）抑制菌体蛋白质的合成（如氯霉素、四环素）；（4）抑制细菌核酸合成（如灰黄霉素）。

　　（三）细菌素（Bacteriocin）

　　是某些细菌产生的一类抗菌物质，作用谱窄，因而治疗应用价值不大。目前认为有一定应用价值的，只是在细菌的分型及流行病学的调查上。

刘利兵