第四节　分子生物学技术在免疫学诊断中的应用

　　一、BCR和TCR基因重排检测

　　对血细胞恶性变如白血病、淋巴瘤等的诊断，长期以来多应用细胞形态学检查和免疫细胞表型分析。由于这些方法在特异性和敏感性上的限制，对于丢失了细胞表面标志，或分化较好难以和正常细胞区别。也可能由于恶性细胞数量少，混在大量正常细胞中难以查出。近年来由于分子生物学技术的广泛应用，且由于获得了Ig片段的特异基因克隆及TCR各链的基因克隆，在此基础上发展了应用Ig基因重排作为B细胞的特异标记，诊断B细胞来源的白血病的和应用TCR基因重排为T细胞特异标志诊断T细胞恶性变引起的白血病，从而将白血病的细胞学分类法提高到基因水平分析，建立了免疫基因型诊断的新方法，大大提高了诊断的敏感性和特异性。该方法不但可以确定细胞来源、分化程度，且由于DNA分析的高度敏感性而能查出显微镜不能看到的微小变化，从而能监测治疗效果，发现微量残留病变细胞。

　　该方法首先要从待检的细胞中分离出总DNA。在非T、非B细胞的Ig和TCR基因不发生重排称为胚基因（germ line）。而T和B细胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排后的Ig和TCR片段，转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后用同位素或酶标记的Ig血病细胞进行分类鉴定，若有Ig基因重排说明恶性细胞来源于B细胞，若有TCR基因发生重排，则为T细胞来源的。如果既无Ig基因重排，又无TCR基因重排的淋巴细胞则属非T、非B细胞来源的瘤细胞。

　　二、限制酶切片段长度多态性组织配型法

　　迄今，一直是血清学和细胞学方法进行HLA抗原结构分析，最近已开始应用分子生物学基因克隆技术进行HLA定型。由于人们已常握了HLA共同和特异的抗原的核苷酸序列，才有可能用此新方法进行组织配型检验。

　　限制酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）组织配型技术的原理是目前已掌握了编码HLA抗原的核苷酸序列，包括各等位基因共有的和专有的序列。HLA-A、-B、-C位点的Ⅰ类重链基因的核苷酸序列有高度同源性，由这些基因片段克隆可得HLAⅠ类专用的探针，因为检测HLAⅠ类抗原序列的标志，目前也已得到Ⅱ类抗原特异的探针。由于HLA等位基因的多态性是表现在其核苷酸序列的差异上，由这些基因中克隆出的特异DNA片段，就可检测这些基因的差别。由于核苷酸序列不同，被限制性内切酶作用部位（切点）也不同，这种酶切点只有4～6个核苷酸长度。因此来源于不同HLA单倍型的DNA可被一种内切酶切成不同长度的片段。在实际工作中，从细胞中提取基因组DNA（genomic DNA）的多态性比实际HLA-Ⅱ类抗原的多态性还要复杂，因为基因的内含子（不转录基因）序列不同，和外显子（转录并翻译成蛋白质）序列差别均在酶切后的细胞总DNA中。

　　RFLP组织配型检测主要包括4个步聚（印迹）：①提取细胞总DNA，用限制性内切酶消化；②凝胶电泳；③将凝胶中分离好的DNA片段转移至尼龙膜上；④经变性处理后用同位素标记的探针进行分子杂交。经放射自显影，得到显影带（bands）。即可得知分子量大小不同的DNA片段（图20-9）。

图20－9　　用RFLP进行组织定型比较三个标本的组织定型

　　RFLP组织配型实验是用于血清学或细胞学检测失败的样品，如HLA抗原不表达（裸细胞）细胞脆性大而破碎，淋巴细胞减少没有足够的样品时。由于分子生物学方法采样少、特异、敏感的优点可弥补常规方法的不足。此外，RFLP组织配型法还可查出DNA变异及基因重组的情况，而血清学方法则不能。PFLP组织配型为器官移植、骨髓移植选择适宜的供体，用比较供体，受体限制酶切片段的长度的差异。两者的RFLP越接近。差别越小，移植效果越好，近年来发展的PCR-RFLP以其简单、敏感、可靠、价廉且无需同位素等优点，已取代了RELP法。

（丁桂凤）