六、趋化因子

　　由组织细胞和微生物产生的趋化剂（chemoattractants)对白细胞的趋化作用（chemotaxis)是炎症发生过程中重要的起始步骤，也是机体防御和清除入侵病原体等异物先天性免疫功能的一个重要方面。1986年以前，“经典”的（classical)白细胞趋化物质主要有补体片段C5a、白三烯B4（leukotrinin B4,LTB4)、血小板激活因子（platelet-activating factor,PAF)和fMLP（N-formylmethionyl-leucyl-phenyl-alanine,N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸），这些趋化物质的受体同属于G蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptor)。

　　（一）趋化因子的种类

　　1.趋化因子的命名　1986年以来，陆续发一现了一类主要由免疫细胞产生的、具有趋化白细胞作用的细胞因子（chemoattractant cytokines或chemotactic cytokines)。在1992年第3届国际趋化因子研讨会上，绝大多数学者建议把chemoattractant(chemotactic)cytokine简称为chemokines,本书暂译名为趋化因子。趋化因子又称可诱导的小分子蛋白（small-inducible protein,SIP）、间分泌（intercrine)、细胞因子PE-4超家族（PF-4superfamily of common an-cestral cytokines)或PF-4样细胞因子（PF-4 like cytokine)等。

　　2.趋化因子亚族及其成员 通过基因克隆和cDNA、氨基酸序列分析，人的趋化因子超家族目前至少发现有19个成员，它们具有以下共同的特点。（1）来自同一个祖先基因（com-mon ancestral gene)。（2）成熟分子为分子量8～10kDa的小分子多肽。（3）可诱导性（inducible)。（4）不同成员在氨基酸水平上有21%～90%的同源性，其中不同亚族成员间同源性，其中不同亚族成员间同源性为21%～31%，同一亚族不同成员间同源性为25%～90%。所有趋化因子均含有4个Cys的保守基序（motif)，组成特征性的两个二硫键。第一个Cys前的N端肽段较短，约4～12氨基酸，第4个Cys后C端肽段较长，为18～24氨基酸。（5）其相应的受体属于G蛋白偶联受体，这类受体有7个跨膜区（seven predicated transmembrane domains,STR)，在胞浆内与三个亚单位所组成的G-蛋白（heterotrimeric G protein)相偶联。

　　根据多肽键一级结构中第1、2两上Cys排列的方式，可将趋化因子超家族分为两个亚族（subfamily)：（1）C-X-C亚族（或α亚族），除NAP-4以外，这个亚族其余成员分子中N端两个Cys之间被另一个氨基酸残基所分隔；（2）C-C亚族（或β亚族），第1、2两个Cys是相连的。两个亚族所包括的成员见表4-11。

表4-11　两个趋化因子亚族所包括的成员

续表1

　　注：（1）NAP-2/CTAPⅢ/βTG是由血小板碱性蛋白（platelet basic protein,PBP)N端加工后形成。

　　（2）LD78和Act-2分别是人的MIP-1α和NIP-1β，与小鼠源性MIP-1α和NIP-1β有很高同源性。

　　（3）GROα、GROβ和GROγ指基因产物。

　　3.趋化因子作用特点　趋化因子C-X-C和C-C亚族的生物学活性有明显的差别。C-X-C亚族中，除γIP-10、Nig和PF-4外，其余成员均具有趋化和激活中性粒细胞的活性。编码这个亚族成员的基因定位于第4号染色体长臂，氨基酸水平上的同源性在25%～90%。γIP-10主要趋化单核细胞和T细胞。C-C亚族主要趋化和激活单核细胞和某些T细胞亚群，基因定位于第17号染色体长臂，而且各成员的基因密切连锁，氨基酸水平上同源性在25%～70%。两个亚族之间同源性为21%～31%。

　　趋化因子除趋化和激活中性粒细胞、单核细胞或某些T细胞亚群外，有些成员还可趋化嗜酸性粒细胞，或趋化嗜碱性粒细胞并刺激其释放组织胺。某些趋化因子还具有刺激造血细胞、成纤维细胞、角化细胞或黑素瘤细胞的生长。趋化因子除了以游离形式发挥作用外，还可结合到细胞外基质(ECM)或内皮细胞表面，从而趋化白细胞到相应的组成或血管内皮处，聚集并激活中性粒细胞或单核细胞。下面仅就C-X-C亚族中的IL-8和GRO以及C-C亚族中MCP-1/MCAF、MIP-1α、MIP-1β和RANTES作一介绍。

　　（二）IL-8

　　1986年Kownatzki等首先证实了单核细胞可产生一种中性粒细胞趋化因子。嗣后，不同实验室根据这种因子不同的生物学活性有不同的命名，如中性粒细胞激活蛋白-1（neu-trophil-activating protein-1,NAP-1），单核细胞来源的中性粒细胞趋化因子（monocyte-derived neutrophil chemotactic factor,MDNCF)，单核细胞来源的中性粒细胞激活肽（monocyte-derived neutrophil-activating peptide,MDNAP),中性粒细胞激活因子（neu-trophil-ac-tivating factor,NAF),中收粒细胞激活肽（neutrophil-activating peptide,NAP)，T淋巴细胞趋化因子（t lymphocyte chemotactic factor,TCF)和内皮细胞来源的中性粒细胞激活肽（endothelial-derived neutrophil-activating peptide,EDNAP)。1988年基因克隆成功，属于C-X-C亚族（α亚族）成员，目前文献中多采用名称是IL-8（interleukin-8)/NAP-1。

　　1.IL-8的产生

　　（1）IL-1、TNF、LPS和PMA均能诱导单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞等合成分泌IL-8。

　　（2）PHA等丝裂原活的T细胞也可产生IL-8。

　　（3）人类多种肿瘤细胞均可高表达 IL-8。其中甲状腺癌、鳞状细胞癌、黑素瘤等可组成性产生IL-8，而星状细胞瘤、肝癌、肾细胞癌等则需要IL-1β或TNF-α等刺激下才合成和分泌IL-8。

　　2.IL-8的分子结构　IL-8分子量8.3kDa，不成熟的IL-8为99个氨基酸，单核细胞产生的成熟IL-8分子主要形式为72个氨基酸，而内皮细胞产生的成熟IL-8分子主要为77个氨基酸。在α亚族中，α与GROα、GROβ、GROγ、ENA-78和NAP-2相对有较高源性。IL-8分子含4个Cys，无N糖基化位上噗，IP8.0～8.5，耐热、耐碱，但对巯基化合物敏感。1988年Matsushima首次获得IL-8cDNA克隆，并在大肠杆菌和中国仓鼠卵母细胞中表达成功。人IL-8基因定位于第4号染色体，基因组有7个外显子和3个内含子。5`端上游有典型的“CAT”和“TATA”盒以及AP-1结合序列和糖皮质反应元件（GRE）等结构。IL-8基因与CXC亚族中PF-4、GROα、γIP-10基因相连锁成熟的IL-8分子的N端，是由蛋白酶水解的不同所致。在体外，凝血酶或血纤维蛋白溶酶可将77氨基酸形式裂解为72氨基酸形式的IL-8，后者较前者的生物学活性要高2～10倍。

　　3.IL-8受体　IL-8受体有两型：IL-8R A型（或IL-8RⅠ）和IL-8r B型（或IL-8RⅡ），两型受体在氨基酸水平上有77%同源性，最近命名为CDw128。IL-8r A特异性结合IL-8，为高亲和力，受体主要分布于中性粒细胞（每个细胞20000受体，Dd为8*10^-10M）、单核细胞、T细胞和黑素瘤细胞。IL-8B除IL-8结合外，还可结合GROβ、GROγ和NAP-2，与IL-8、GROα、GROβ和GROγ结合为高亲和力。与IL-8r B结合的这5种配体分子近N端均具有一个Glu-Leu-Arg(ELR)序列，可能是与IL-8r B结合的一个重要结构。此型受体主要分布于中性粒细胞和髓样细胞前体细胞系，如HL60细胞系。IL-8R属于G蛋白偶联受体，与fMLP受体和C5a受体有29%～34%同源性。IL-8与相应受体结合后可使细胞内Ca²⁺浓度短暂升高，百日咳杆菌毒素（IAP）可抑制IL-8的这种刺激作用，表明IAP敏感的G蛋白与IL-8受体的信号转导有关。此外，细胞膜磷酸肌醇脂代谢和PKC也与IL-8R的信号转导有关。最近证实人红细胞膜表面Duffy抗原（gpD）可结合包括IL-8在内的多种趋化因子，这种受体还分布在肾脏和大脑，可能具有清除循环中IL-8等趋化因子的功能，在炎症发生过程中具有重要的调节作用。

　　4.IL-8的生物学活性

　　（1）趋化和激活中性粒细胞：IL-8的这种效应无明显种属特性。动物腹腔或静脉注射IL-8可引起外周血中性粒细胞数量的增加。IL-8可使中性粒细胞外形改变，促进其脱颗粒，激活中性粒细胞并使其产生呼吸爆发（respiratory burst)、释放超氧化物（O2-、H2O2）和溶酶体酶。局部注射IL-8可趋化中性粒细胞，并刺激中性粒细胞产生白三烯B4（LTB4）而使皮下血浆渗出，IL-8还能诱导中性粒细胞上调Macl抗原（CD11b/CD18)的表达，促进中性粒细胞粘附到内皮细胞和内皮细胞下的基质蛋白。

　　（2）趋化嗜碱性粒细胞，并刺激其释放组织胺，可能与速发型超敏反应的发生有关。此外，还可刺激GM-CSF或IL-5预先处理的嗜酸性粒细胞的脱颗粒作用。

　　（3）趋化T淋巴细胞：可趋化部分静止的CD4+或CD8+T细胞，这种趋化作用需要单核细胞的同时存在。局部注射IL-8可使局部和引流区淋巴结T细胞明显增多。IL-8还可明显趋化IL-2活化和NK细胞。

　　（4）IL-8是角化细胞的复合促有丝分裂原（co-mitogen)，也是黑素瘤细胞的自分泌生长因子。

　　5.IL-8与临床　目前关于IL-8与疾病的关系的研究仅仅开始。已发现牛皮癣皮屑中和类风湿性关节炎关节滑液中含有IL-8，IL-8可诱导中性粒细胞产生软骨降解酶，引起关节组织损伤，皮质激素能抑制非特异性炎症可能与抑制IL-8的产生有关。此外，某些与中性粒细胞积聚有关的炎症和呼吸系统疾病局部或血清中IL-8水平往往升高，如胃炎、炎症性结肠炎、肺纤维化或成人呼吸窘迫综合征、支气管肺泡灌洗液、慢性支气管炎、支气管扩张、败血症休克、急性脑膜炎球菌感染、酒精性肝炎等。IL-8水平升高往往与局部浸润的单核细胞和中性粒细胞数量相平行。

　　IL-8与 IL-1、TNF-α、G-CSF、GM-CSF或IFN等联合应用有可能治疗中性粒细胞减少症以及HIV所致的免疫缺陷症等。肿瘤局部注射IL-8可趋化中性粒细胞、T细胞和NK细胞，在治疗肿瘤中可能有应用前景。

　　（三）GRO

　　GRO（growth related gene,生长相关基因）可分为GROα、GROβ和GROγ三种，此处指基因产物，属于C-X-C亚族。GROα又称为黑素瘤生长刺激活性（melanoma growth-stimulating activity,MGSA),常以GROα/MGSA表示。GROα与GROβ和GROγ分别有90%和86%的同源性。GROα、GROβ和GROγ与ENA-78和NAP-2也有较高的同源性。此外，在DNA和氨基酸水平上人GRO与细胞因子诱导的大鼠中性粒细胞趋化剂（CINC)、小鼠巨噬细胞炎症蛋白-2（murine macrophage inflammatory protein 2,MIP-2)也有较高的同源性。

　　GPOα前体长107氨基酸，切除N端34氨基酸先导序列后形成73氨基酸的成熟分子。单核细胞、成纤维细胞、黑素瘤细胞、上皮细胞和脐带静脉内皮细胞等经血清、PDGF或IL-1、TNF等炎症介质刺激下均可表达GPOα，在某些肿瘤细胞GPOα的表达是组成性的（con-stitutive）。GPOα趋化人中性粒细胞的能力约为IL-8的10倍，但在激活中性粒细胞并刺激其脱颗粒的作用则弱于IL-8。体内试验表明，GPOα与急性炎症的发生密切相关，使炎症局部有大量中性粒细胞浸润。GPOα对单核细胞则无趋化作用。GPOα对人Hs294T黑素瘤细胞的生长有一定的刺激活性，对滑膜来源的成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达有下调作用。GPOα与IL-8RB有高亲和力的结合，还可与人红细胞膜Duffy抗原（gpD)结合。

　　（四）MCP-1/MCAF

　　单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)又称单核细胞趋化和激活因子（monoctye chemotactic and activating factor,MCAF)，属于C-C亚族（β亚族）成员。MCP-1/MCAF起初是从人髓样单核细胞系THP-1、神经胶质瘤细胞系以及LPS或PHA刺激的人PBMC培养上清中发现。目前已知，单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、B细胞、平滑肌细胞等在PHA、LPS、Poly I-C、IL-1、IFN-γ、PDGF、EGF或某些病毒刺激下均可被诱导分泌MCP-1。某些肿瘤细胞系则可组成性产MCP-1。

　　人MCP-1/MCAF基因定位于第17对染色体。人MCP-1前体长99个氨基酸，切除23个氨基酸先导序列后形成76氨基酸的成熟分子，为碱性蛋白。非糖基化的MCP-1分子量8.7kDa，经不同糖基化后MCP-1分子量有13kDa两种。MCP-1分子中11与36Cys和12与52Cys之间所形成两个链内二硫键以及Try28和Arg30，对于MCP-1的生物学活性是必需的。在氨基酸水平上，MCP-1与另外两种单核细胞趋化蛋白MCP-2（HC14）和MCP-3（NC28）分别有62%和72%同源性，与C-X-C亚族中IL-8有24%同源性。

　　体内和体外实验均证实了MCP-1对单核细胞具有趋化活性，激活单核细胞和巨噬细胞，使其胞浆内Ca2+浓度升高，超氧阴离子的产生和释放，并释放溶菌酶，上调单核细胞和巨噬细胞粘附分子如integrin家族β2组和α4分子的表达和细胞因子IL-1、IL-6的产生，活化的巨噬细胞可抑制肿瘤细胞的生长。MCP是嗜碱性粒细胞的趋化剂和激活剂，尤其是刺激嗜碱性粒细胞脱颗粒和组胺释放的作用较为强烈。MCP-1与MCP-1R发生特异性的结合，此受体主要分布于单核细胞、髓样前体细胞系和嗜碱性粒细胞，属于IL-8R家族。分布于人红细胞表面的Duffy抗原也可结合MCP-1。

　　风湿性关节炎病人的滑液和血清中MCP-1水平明显升高，滑液组织巨噬细胞组成性地产生MCP-1，提示MCP-1与风湿性关节炎的病理损伤有关。高胆固醇血症时，动脉内侧平滑肌细胞产生高水平MCP-1，单核细胞粘附于血管壁并浸润动脉壁。肾脏炎症时，IL-1诱导肾小球细胞产生MCP-1。高血脂症时，LDL与肾小球细胞结合，刺激其产生MCP-1，趋化单核细胞在局部浸润。

　　（五）MIP-1α和MIP-1β

　　巨噬细胞炎症蛋白1（macrophage inflammatory protein 1,MIP-1)最初从LPS刺激小鼠巨噬细胞上清中发现。根据MIP-1分子结构的差异，可分为小鼠MIP-1α和MIP-1β，人的MIP-1α又称LD78，人的MIP-1β又称Act-2。在同一种属中，MIP-1α和MIP-1β间约有70%同源性。不同种属MIP-1之间也有较高的同源性，如人和小鼠MIP-1β有间约有70%同源性。不同和中属MIP-1之间也有较高的同源性，如人和小鼠MIP-1β有77%同源性，并且人和小鼠MIP-1α和MIP-1β均有种属交叉反应性。成熟的人和小鼠MIP-1β分子均为69个氨基酸，MIP属于C-C亚族（β亚族）的成员。

表4-12　MIP-1α和MIP-1β生和的学活性比较

　　注：（a）MIP-1β对某些生物学功能的调节作用尚未见有报道。

　　（b）T细胞需MIP-1预处理；内皮细胞需经MIP-1等因子的刺激，使之表达VCAM-1分子。

　　活化后的T细胞、B细胞、单核细胞和肥大细胞均表达MIP-1α和MIP-1β。MIP-1α和MIP-1β均可趋化单核细胞，但对其它细胞的调节作用则有所差别（表4-14）。

　　MIP-1α与MIP-1α/RANTES受体结合，MIP-1α/RANTES受体正如命名所示，除与MIP-1α配体结合外，还可与RANTES结合，此型受体主要分布于单核细胞、T细胞、髓样细胞前体细胞系、B细胞以及嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等。

　　（六）RANTES

　　RANTES是reduced upon activation,nornal T cell expressed and secreted的略写词，国内尚未见翻译的专业术语，从产生条件角度一为试译，似为此种趋化因子在正常T细胞表达和分泌，活化时其产生水平则降低。RANTES最初认为是只是T细胞产生的，以后发现，RANTES与凝血酶刺激人血小板所释放的嗜酸性粒细胞趋化物质是同一种分子。除T细胞（CD4+和CD8+）和血小板外，肾小和官上皮细胞、肾小球膜细胞、肾脏、肝脏等也可表达RANTES。人RANTES的前体是高度碱性的蛋白，91个氨基酸，切除23个氨基酸先导序列后成熟分子含68氨基酸，与MIP-1α和MIP-1β有较高同源性。作小鼠RANTES在氨基酸水平上同源性有90%以上。RANTES属于C-C亚族（β亚族）成员。

　　RANTES对多种白细胞具有趋化或/和刺激作用：（1）趋化单核细胞；（2）趋化未刺激的CD4+CD45RO+记忆T细胞以及活化后的CD4+和CD8+T细胞；（3）趋化嗜酸性粒细胞并刺激其脱颗粒和呼吸爆发；（4）是嗜碱性粒细胞较强的趋化剂，但刺激其组织胺等介质释放的作用较弱；（5）RANTES预外理T细胞可增加其与IL-1α刺激内皮细胞的粘附能力。

　　百日咳杆菌外毒素可抑制RANTES的生和的学活性，提示其受体跨膜信号的转导与IL-8R相似。RANTES与MIP-1α/RANTES受体相结合，些型受体主要分布于单核细胞、T细胞、髓样细胞前体细胞系、B细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等，如人单核细胞性白血病细胞系THP-1上与MIP-1α/RANTES结合位点每个细胞约700个，Kd值700pM。