第一节　在细菌学中的应用

　　免疫细胞化学在细菌学中主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究。细胞都各自有其特异性抗原，应用特异性抗体的荧光素或酶标记物，可以鉴定任何一种细菌。已经成功地用于鉴定几乎所有致病菌的纯培养。尤其是应用免疫荧光技术具有较其他血清学方法简便、快速和敏感等优点，并能直接进行细菌形态观察。可用于鉴定的材料也比较多样，如培养物、感染组织、病人分泌排泄物，外环境中采集材料（土壤、水、杂物等）。由于此法对某些传染病原能较常规方法作出更快速的诊断，因而具有特殊意义。

　　免疫细胞化学方法用于研究细菌抗原结构和形态学观察，由于单克隆抗体的应用，比其他方法更为有效。

图16-1　免疫荧光在病原细菌诊断程序中的应用时机

　　从患者咽部粘膜用棉拭子取标本，作涂片用甲组溶血性链球菌荧光抗体染色，能够很快作出诊断。对于痢疾杆菌、霍乱孤菌、布氏杆菌、炭疽杆菌和脑膜炎双球菌、肺炎双球菌等的实验诊断均有较好的效果（如表16-1）。

　　利用间接免疫荧光或酶标记抗体法，检测患者血清中的抗体更有价值，广泛用于临床诊断和流行病学研究。

表16-1 免疫荧光细胞化学方法在细菌诊断中的应用评价

　　（引自，黄策：免疫荧光和荧光免疫。1983）

　　一、甲组溶血性链球菌的快速检查法

　　（一）试剂制备

　　用抗甲组溶血性链球菌的抗体，以FITC标记，制成荧光抗体，再用C和G链球菌充分吸收；或用抗I型链球菌M蛋白成分的血清，标记后吸收，都有可靠的特异性。

　　（二）检查方法

　　（1）以棉拭子擦拭患者咽部粘膜，取标本。

　　（2）将拭子浸入1ml肉汤小试管内，37℃培养2～3h。

　　（3）取出棉拭了作分离培养，常规鉴定。将肉汤液离心3～4min,3000r/min,弃上清，沉淀加0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗涤，再离心沉淀，弃上清。

　　（4）以沉淀涂片，直径约1cm,涂两个圆形区。

　　（5）将标本放入95%酒精中固定1min，然后浸入PBS中洗1次，取出室温晾干。

　　（6）直接法染色，左侧标本作对照，加非溶血性链球菌荧光抗体染色。右侧加甲组溶血性链球菌荧光抗体染色。置湿盒中孵育20～30min，再用PBS洗2次，每次5min，振动洗涤，滤纸吸干标本周围的水。

　　（7）加缓冲甘油封裱，立即荧光显微镜观察。

　　免疫荧光检出的阳性率较培养法为高，因为前者可以检出抗菌素治疗后的死菌。二者符合率达95%。

　　二、脑膜炎双球菌的快速检查法

　　（一）制备荧光抗体

　　可用多价和I、II、III、IV型单价的脑膜炎球菌抗血清，分别制备多价和单价荧光抗体。

　　（二）检查方法

　　用患者咽拭子，脑脊液或培养标本制备涂片，晾干，火焰或乙醇固定，37^℃中染色30min，荧光显微镜检查。

　　抗脑膜炎双球菌的荧光抗体有很高的特异性，可以快速检出和鉴定脑膜炎双球菌。有人应用免疫荧光检查267例脑膜炎病人脑脊液中脑膜炎双球菌，阳性率73.4%，培养和普通染色则只分别为41.9%和34.4%。

　　三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法

　　霍乱和副霍乱是严重的传染病，快速诊断才能及早防治。取病人粪便标本直接涂片荧光抗体染色检查，与常规培养法比较，具有快速特异和检出率很高的优点。尤其适用于急性期病人的诊断。

　　四、鼠疫杆菌的快速检查法

　　鼠疫是烈性传染病，快速及时的诊断对于控制流行和救治病人有决定性意义，免疫荧光快速诊断方法是一种特异和敏感的手段。直接法和间接都可应用，以直接法更简便。

　　五、炭疽杆菌的快速检查法

　　炭疽也是一种烈性传染病，早期快速诊断对救治病人有决定性意义。免疫荧光检查方法对炭疽杆菌的检出率很高。应用抗夹膜荧光抗体检查炭疽杆菌有十分确定的诊断意义。也可用间接法检测血清中抗夹膜抗体。

　　六、致病性大肠杆菌的快速检查法

　　（1）制备当地常见的致病性大肠杆菌荧光抗体。

　　（2）取病人大便标本或直肠拭子以生理盐水搅和涂片，晾干，火焰固定。

　　（3）直接法免疫荧光染色，立即荧光显微镜检查。

　　由于本菌较其他非致病性大肠杆菌组有特殊的抗原，不易发生强交叉反应。所以，在儿童肠炎和引起人群暴发性肠炎时更准确、快速和简便。

　　七、结核杆菌的快速诊断方法

　　结核杆菌感染机体后可以诱导产生抗体，可用间接法检查血、胸腹水和脑脊液中的抗体。

　　也可用抗结核杆菌的荧光抗体直接法检查抗原。

　　八、其他细菌的快速检查方法

　　对军团杆菌、布氏杆菌、土拉杆菌、产气夹膜杆菌等的快速诊断，效果良好。

　　九、钩端螺旋体的检查法

　　（1）根据当地钩端螺旋体的型别制备多价抗体、标记FITC制成荧光抗体。

　　（2）检查方法：

　　①血液标本的检查：取发热期的病人或发病动物的血液约2ml，制取血浆，并加入钾明矾（0.058g/ml），振荡混匀后置室温10～15min，然后中速离心沉淀，取沉渣涂片，晾干，95%酒精固定。免疫荧光染色，镜检。

　　②尿液标本检查：取病人或动物尿液约2～3ml，高速离心，取沉渣涂片，无水乙醇固定，免疫荧光染色，镜检。

　　③脏器标本的检查：取发病动物的肾脏皮质部分，以刀片切出整齐断面，滤纸吸去血液，再以洁净载玻片压印制片，晾干后以丙酮在4℃固定。经10%甲醛固定的组织可作冰冻切片，依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定，荧光抗体染色前以3%表面活性剂如Tween20处理切片，据称，这样可使荧光强度增加4倍。

　　④培养液检查：同尿处理。

　　⑤特异性抗体的检查：用适当血清型的钩端螺旋体作抗原，用间接法检查病人血清中的特异性抗体，可用于流行病学调查和临床追溯诊断。此检查适用于人类和家畜等。

　　本法诊断钩端螺旋体，一般只具有属的特异性，鉴定抗体则可能达到型的特异性。

　　十、梅毒螺旋体的检查法

　　免疫荧光细胞化学应用于梅毒血清学诊断有很多文献报道。70年代应用PAP法又将敏感性提高了许多倍，此法已作为梅毒诊断的常规方法。用间接免疫荧光法可PAP法，取已知梅毒螺旋体作抗原，检查病人血清中的特异性抗体。

　　（一）抗原制备

　　以标准株（如Nicol株）梅毒螺旋体感染家兔睾丸，约1周后待睾丸产生明显炎症，剖腹将睾丸摘除，仔细清除精索、附睾和包膜，然后以灭菌器械将其剪成薄片，置于烧瓶内，加入20ml生理盐水，振荡30min，使螺旋体逸出，2000r/min离心10min以除去组织碎块和血细胞，将上清高速离心（10,000r/min）30min，去上清，沉淀以5ml生理盐水洗涤，再高速离心，洗涤，反复3次以上，以尽可能除去组织成分和家兔球蛋白，最后以pH7.2PBS(内含0.01%硫柳汞或数滴福尔马林以防腐)将沉淀制成敏感毫升约含10，000，000螺旋体的悬液，置4℃保存备用。有效期约半年。

　　（二）荧光抗体

　　用抗人IgG和IgM荧光抗体。为诊断新生儿先天性梅毒，必须用抗人IgM荧光抗体。

　　所有稀释用PBS 0.1mol/L Na₂HPO₄-KH₂PO₄,0.15mol/l NaCl Ph7.2含1%Tween-80。

　　（三）间接免疫荧光染色方法（FIA试验）

　　1．定性检查　　先将待检血清灭活。在载玻片上以白金耳取抗原液涂片，每片涂4个点，在室温中晾干，丙酮固定10min。各点分别加－1：50稀释待检血清；②－1：200稀释阳性血清；③－1：50稀释阴性血清；④－PBS。放入湿盒，在37^℃或室温中放置20min，用PBS振荡洗涤10min，再加适当稀释的抗人IgG和IgM荧光抗体，再同上条件下放置20min，水洗，封裱，镜检。结果如①、②荧光阳性，③、④阴性，待检血清即判断为阳性。阳性时梅毒螺旋体呈明亮的黄绿色荧光，亦有人将待检血清稀释1：200作定性检查，这样可排除低稀释时正常人可出现的假阳性反应，此法又称FTA-200试验。

　　2．滴度测定　　如定性检查阳性，则被检血清应进一步稀释成1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600……以定出染色滴度，滴度疑点以螺旋体发“++”荧光为标准。

　　（四）荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 简称FTA－ABS）

　　FTA-200试验敏感性较差，有时查不出潜伏期和晚期梅毒。FTA－ABC试验不但敏感性高，而且特异性更好。方法是将非致病性螺旋体Reiter株的培养液于121℃高压加热10min，然后高速离心、沉淀，取其上清浸液作为吸附剂，并用以稀释病人血清（1：5），然后如上法（FTA试验）进行染色检查。

　　FTA-ABC所用的反复洗涤过的纯梅毒螺旋体抗原，推荐置1.0%清蛋白、0.0375mol/l 葡萄糖、0.01mol/L二氯化镁和0.85%氯化钠溶液（用0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.8配制）中冰冻干燥保存，其中清蛋白起保护剂的作用，葡萄糖可增加折光率，二氯化镁维持螺旋体的形态学，缓冲液稳定pH。

　　（五）梅毒螺旋体的直接检查法

　　取梅毒局部硬结渗出液涂片，用直接法或间接法免疫细胞化学染色，更容易发现隐藏在细胞碎片之间的螺旋体。免疫荧光检出效果和暗视野检一样敏感。如用RB200标记牛清蛋白作初染色，图像更为清晰。