第八章　蛋白质与多肽激素的放射免疫分析

第一节　概述

　　1960年，美国学者Yalow 和Berson 创立了放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），并首先用于糖尿病人血浆中胰岛素含量的测定。这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。其后30年中，内分泌科学的飞速进展，充分证明了这一超微量分析技术的巨大推动力。1977年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其它领域，如病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一切生物活性物质。我们放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速发展与普及，对我国生物医学的进展起着很大的促进作用。

　　一、放射免疫分析的优缺点

　　（一）RIA的优点

　　放射免疫分析具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质。

　　1．灵敏度高一般化学分析法的检出极限为10^-3～10^-6g,而RIA通常为10^-9（毫微克，ng）、10^-12g（微微克,pg），甚至10^-15g(毫微微克，fg)、10^-18g(微微微克，ag)。

　　2．特异性强由于抗原—抗体免疫反应专一性强，所被测物一定是相应的抗原。良好的特异性抗体，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。

　　3．应用范围广据不完全统计，目前至少已有300多种生物活性物质已建立了RIA。它几乎能应用于所有激素的分析（包括多肽类和固醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析，应用范围还在不断扩展。近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于RIA的探测极限，都可建立适当的RIA法。

　　4．操作简便RIA所需试剂品种不多，可制成配套试剂盒；加样程序简单一次能分析大量标本，标本用量也少；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化；RIA属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。

　　（二）RIA的缺点

　　1．只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质，对具有生物活性百失去免疫活性的物质是测不出的。因此RIA结果与生物测定结果可能不一致。

　　2．由于使用了生物试剂，其稳定性受多种因素影响，需要有一整套质量控制措施来确保结果的可靠性。

　　3．灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测定。

　　4．由于放射免疫分析是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量。

　　5．存在放射线辐射和污染等问题。

　　尽管RIA存在以上缺点，但它毕竟是定量分析方法的先进技术。随着科学技术的进步，放射免疫分析技术将会得到更加广泛、更加深入的发展。

　　二、基本原理

　　放射免疫分析技术，是把放射性同位素测定与抗原、抗体间的免疫化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种超微量物质的测定方法。

　　RIA的基本原理，是利用标记抗原（*Ag）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）发生竞争性结合。竞争结合反应可用下式表示：

　　在上述反应系统中，当只有*Ag和Ab时，只产生*Ag—Ab复合物，并保持可逆的动态平衡。如反应系统中同时加入Ag,因Ag 与*Ag 免疫活性完全相同，故与Ab具有相同的亲合力。当*Ag为一定量、Ab为有限量、Ag 与* Ag 的量之和超过Ab上的有效结合位点时，*Ag –Ab复合物的生成量与Ag 的量之间呈一定的函数关系。即当Ag 量少时，Ag –Ab生成量多，而*Ag –Ab生成量增多，游离的*Ag 减少。可见*Ag –Ab复合物生成量是受Ag含量制约的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同浓度的标准物和一定量的*Ag及限量的Ab反应，采取一定方法将B与F分开，即可算出该标准物在各浓度下*Ag –Ab复合物的结合百分率（B/T）。

　　这一反应过程，可用以下简图（图8-1）说明。图中黑圈表示标记抗原，白圈表示非标记抗原，长条代表抗体，每个抗体有两个结合位点，标记抗原与非标记抗原对抗体有同等的结合能力。

图8-1 放射免疫分析原理示意图

　　从图中可见，当标记抗原与抗体量一定时，结合率（B/B+F）随抗原量增加而降低。在实际工作中，以B/T的值为纵座标，标准物的浓度为横座标，绘成曲线，即竞争性抑制曲线，或称准确曲线。将未知浓度的样品按同样条件操作，所得结合率（%）与标准曲线相比，即可查出样品中待测抗原的浓度。

　　放射免疫分析典型的操作程序如下：首先配制一系列已知浓度的标准溶液，并各取一定体积；于其中加入一定量的标记抗原和特异性抗体；在一定条件下使之反应平衡后，采取适当方法将B与F分离；分别测量其放射性；绘制标准曲线（图8-2）。对样品中抗原的测定，则可在同样条件下操作，在标准曲线上查得含量。

图8-2 标准曲线左：横座标为等份刻度；　右：横座标为对数刻度

　　由此可见，要成功地进行放射免疫分析，必须解决好以下3个关键性技术问题：

　　（1）标记抗原：要求其纯度高、免疫化学活性好、比放射性强、用量适当。

　　（2）制备抗体：要求其特异性高、选用的稀释度适当。

　　（3）分离B与F：理想的分离方法应当是分离完全、稳定可靠、操作简单、适用范围广。