第三节　凝集素

　　凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。其常见种类见表6-1。常用的为植物

表6—1 常见的凝集素一览表

　　凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它们的总称。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，它们之所以被收入本书，是由于凝集素具有的某些“亲合”特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。因此，Ponder（1983）提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。

　　一、凝集素的特性

　　凝集素具有多方面的特性，在此我们仅简要提及其与免疫细胞化学技术方法应用有关的某些特性。我们知道，生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特点在于它们能识别糖蛋白和糖肽中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳脂化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力，如刀豆素与α—D—吡喃糖基甘露糖（α—D—Mannopyranosy）结合；麦芽素与N—乙酰糖胺（N—acetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与N—乙酰乳糖胺结合（见本章　表6—1）。 因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜与/或电镜水平显示其结合部位。

　　二、凝集素的应用

　　一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型和反映细胞在分化、成熟和肿瘤细胞性变中的变化。仅在某些特殊的例子，其细胞结合凝集素的性能可以预先估计，如双花扁豆素之于血型A物质的特异性，荆豆凝集素之于血型O物质2—L—岩藻糖的特异性，然而在绝大多数情况下，关于由凝集素所识别的碳水化合物决定簇的种类，关于携带决定簇的分子的性质和机能，完全凭实验经验去发现。

　　1．作为细胞分化和成熟的标记 　应用凝集素作为细胞分化的标志，在这方面的应用报告最多，而且研究比较集中于血细胞，特别是淋巴细胞的分群。如Rose（1980）等发现在小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的T淋巴细胞，是值得进一步研究的问题。Newman等（1979）以荧光素标记凝集素PNA，发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞，荧光弱或无，随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光程度逐渐加强，而泌乳期荧光强度达最高峰。在皮肤角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中，细胞表面的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed等（1981）应用新生大鼠皮肤的实验表明，皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合，蓖麻素与棘细胞和基底细胞相结合，而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在成肌细胞（myeoblast）的分化与成熟过程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到类似的皮肤的改变。

　　2．作为细胞特殊类型的标记　Kivela和Farkkanen（1987）发现在人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应而肌上皮细胞和间质细胞呈PNA阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。应用DBA对RIII和DDK品种的小鼠研究表明，DBA主要结合在各种组织内毛细血管内皮细胞上，电镜观察显示DBA结合在内皮细胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的DBA阴性反应，说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit和Kreutzberg（1987）发现Griffonia Simplicifolia凝集素特异性标记面神经节　内的小胶质细胞，其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞（astrocyte）等都显示阴性反应。在切断面神经后，增殖的小胶质细胞对Griffonia Simplicifolia凝集素的反应加强，免疫电镜观察表明，凝集素主要沉积在细胞膜或小胶质细胞突起的轴膜表面，特异性结合糖基是α—D—半乳糖。上海医科大学附属肿瘤医院免疫病理室应用12种凝集素（表6-1）对人胚胎及各种正常组织进行了系统的凝集素受体的定位研究，结果表明，凝集素受体的分布并无即定规律可寻。如胃粘膜主细胞为PNA受体，而壁细胞为BSL受体，双花扁豆受体（DBA）主要出现在大肠部份。

　　3．在肿瘤中凝集素结合的改变 　肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。大量研究发现，凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等（1987）报道115例胃癌标记PHA阳性率高达90.43%，而正常胃粘膜基本是阴性，故认为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79%，而对良性病变均呈阴性反应，提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。凝集素还有助于判别肿瘤的组织类型，如神经系统星形细胞瘤ConA阳性，小胶质细胞瘤阴性，肾腺癌UEA1阴性，透明细胞癌阳性。

　　三、凝集素在免疫细胞化学中的应用

　　凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记，分别进行下列染色法：

　　1．直接法　 标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。

　　（1）切片脱蜡至水。

　　（2）凝集素标记物（100μg/ml），室温，30min。

　　（3）TBS洗3次，每次2min。

　　（4）如为荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物，则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。

　　直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。

　　2．间接法 　将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上。

　　（1）脱蜡至水。

　　（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。

　　（3）凝集素稀释液（100μg/ml）孵育30min。

　　（4）TBS洗3次，每次2min。

　　（5）用标记了的抗凝集素抗体（1：100）孵育30min。

　　（6）TBS洗3次，每次2min。

　　（7）呈色、脱水、透明、封片。

　　（8）观察。

　　间接法染色还可进一步改良为：①三步法：即在凝集素孵育后，接着用抗凝集素抗体孵育，再用标记了的抗-抗凝集素抗体孵育，层层放大，进一步提高其敏感性，PAP复合物也可作为标记物标记在抗-抗凝集素抗体上。②抗生物素—生物素凝集素法：用结合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—标记物与之结合。间接法较直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必须购买或自制抗凝集素抗体。

　　3．糖—凝集素—糖法　 本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖—凝集素—糖的结合物。

　　（1）脱蜡至水。

　　（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。

　　（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。

　　（4）TBS洗3次，每次3min。

　　（5）用100μg/mlHRP标记的糖液孵育30min。

　　（6）TBS洗3次，每次3min。

　　（7）DAB呈色、脱水、透明、封固。

　　本法特异性强，灵敏度高，因为这不象生物素—抗生物素法那样要改变凝集素，又不需要像抗体那样要制备抗体。HRP本身含有甘露糖，能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素，本法目前普及还有一定困难，因为要将过氧化物酶结合到其它凝集素上，就需要将一个适当的碳水化合物基团嵌入过氧化物酶，称为糖基化（glycosylation），方法虽不复杂（Lee 等1976），但需一定的试剂和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限。

　　【注意事项】

　　①凝集素需要重金属离子维持其活跃的结合部位，如果金属离子耗尽了，就会影响凝集素的结合能力。因此，有作者主张用TBS作为缓冲液，内加微量的金属，配方是：Tris 60.57g,NaCl87g, H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L。或在进入凝集素孵育前，先用该液孵育，以增强凝集素结合力。

　　②和其它抗体血清应用一样， 应用每批新的凝集素实验时，都先要用缓冲液稀释成不同等级；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，经染色选择最佳稀释度。

　　③有作者认为阻断组织内源性过氧化物酶所用的H2O2对碳水化合物有影响，可能改变凝集素的结合形式，因此，应尽量少用或不用，我们及一些作者在实验过程中发现影响不明显。

　　④有作者认为凡经固定的组织切片，不论是石蜡包埋切片或冰冻切片，都有可能使组织中抗原隐蔽，为了暴露隐蔽了的碳水化合物基团，主张在凝集素孵育前用酶处理切片，常用胰蛋白酶液（配制见附表）进行适当的孵育。

　　⑤已知哺乳动物的质膜含有占蛋白总量的1%～10%的碳水化合物，它们以低聚糖（oligosacchride）糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白线性的或分支的旁链可能含有两个到多个单糖残基，通常有两种或更多的单糖，在单糖单位末端常常是一个带负电荷的N-乙酰神经氨酸的残基，一个唾液酸（siallic acid）。有作者在凝集素实验中常用神经氨酸酶(neuramidinase)分解细胞表面的唾液酸或神经氨酸，以暴露出隐蔽的能与聚集素结合的次终末的碳水化合物。配制方法是将神经氨酸酶（Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172）用醋酸缓冲液（含2%牛血清白蛋白）BSA配成0.5μg/ml。

　　切片脱蜡后进行酶消化的过程中，将该组织切片置于上述配制液中，在湿盒内，37℃孵育30min。用缓冲液洗后，进行凝集素染色。

　　⑥对照试验，和其它组化染色一样，凝集素染色也需要设对照试验（最好在相邻切片进行）。由于凝集素具有单糖特异性，如果外加相应的糖，把凝集素的结合部位占有了，凝集素就不能再与组织中的糖基相结合了。一般采用的方法是将凝集素预先与相应的糖（0.2mol/L）在室温孵育30min，使之占有凝集素结合部位，再将此液代替凝集素进行孵育，结果应为阴性。在某些情况下即使提高糖液的浓度也不能达到完全的抑制。这时，只有用与凝集素有高亲合力的低聚糖（oligosachrides）代替或将切片预先用相应的糖苷酶孵育去除特异性糖基（Watanalte等，1981）。

　　四、HRP标记凝集素及凝集素抗体的制备

　　1．HRP标记凝集素法 　　适用于小量的凝集素标记（Ponder 1983）。

　　（1）HRP的活化

　　①将10mg HRP(Sigma Type VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸钠溶液中（1.25g/50ml）。

　　②加50μl含1%氟二硝基苯的无水乙醇溶液，室温轻度搅拌1h。

　　③加1ml含0.06mol/L的过碘酸钠的蒸馏水（0.62g/50ml），室温下轻度搅拌30min。

　　④在室温下加两滴0.16mol/L乙二醇，轻搅1h。

　　⑤用Sephadex G—25装成小柱，用0.3mol/L的重碳酸钠溶液，使含HRP的混合液过柱。

　　（2）结合

　　①正常条件下，可用凝集素及过氧化物酶各半量，但其比例可根据需要调整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸盐缓冲液里，加到“活化”的HRP中去 ，这样得出的凝集素浓度大约是0.3mg/ml，可加进0.1mol/L相应的特异的糖，以保护凝集素结合时的结合部位。糖在下步透析或层析时去掉。

　　②在室温下轻搅拌，结合3h。

　　③加入1mg硼氢化钠，室温下作用1h以稳定结合物活性。

　　④用1N HCl调整pH至6.4，留置室温下过夜。

　　（3）纯化

　　①用适当的凝胶层析柱如Sephadex G—200、Saphacryl—300层析法将游离的凝集素、游离的过氧化物酶和高分子量的成分从结合物分离出去，包括抑制性的糖也在此时分离出去。

　　②提纯后的结合物在280nm和403nm波长处测量其吸光率。用1%BSA先通过0.22μm的微孔过滤器，以确定被结合的凝集素是否被吸附在滤器中，然后上述结合物经过该微孔滤过器过滤到一个无菌瓶中。

　　③加入叠氮钠，浓度1：1000，保存于4℃C备用。

　　2．抗凝集素抗体的制备 　抗凝集素抗体的制备法与一般免疫血清制备大致相同（见第二章　）。所不同的是：①凝集素具有较强的毒性，易使被免疫动物发病或甚至死亡。解决的方法是经处理使凝集素变性，从而减低其毒性，但同时要保证其抗原性不受或少受破坏。②要设法阻断凝集素的糖结合部位，以减少对这些部位的抗体的产生，解决的办法是预先以相应的糖阻断这些结合部位。Leathem 和Atkin（1982）设计了一个办法，他们首先应用琼脂糖（Sepharose）珠，珠上有一系列共价糖的附着，这些糖可阻断凝集素结合部位，这种糖珠有商品供应（Sigma LtD），每1ml糖珠能结合大约12mg凝集素。其次用加入福尔马林和加热的方法使凝集素变性，毒性减低而不影响抗原性。具体操作如下：

　　①1ml琼脂糖—半乳糖珠与1mg花生凝集素相结合，室温1h。

　　②加入10ml 10%福尔马林，在水浴中加热到60℃，1h。

　　③用盐水离心洗珠，将珠分成以10μl为单位的若干小份，保存在-20℃。

　　④皮下多处注射两只家兔背部，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃备用。