第二节　RNA转录后的加工与修饰

　　不论原核或真核生物的rRNAs都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。然而绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着mRNA开始的DNA上合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程，相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA。hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。

　　（一）mRNA的加工修饰

　　原核生物中转录生成的mRNA为多顺反子，即几个结构基因，利用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条mRNA，所以此mRNA分子编码几种不同的蛋白质。例如乳糖操纵子上的Z、Y及A基因，转录生成的mRNA可翻译生成三种酶，即半乳糖苷酶，透过酶和乙酰基转移酶。原核生物中没有核模，所以转录与翻译是连续进行的，往往转录还未完成，翻译已经开始了，因此原核生物中转录生成的mRNA没有特殊的转录后加工修饰过程。

　　真核生物转录生成的mRNA为单顺反子，即一个mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。

　　真核生物mRNA的加工修饰，主要包括对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。

　　1．在5’端加帽

　　成熟的真核生物mRNA，其结构的5’端都有一个m7G-PPNmN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。如图17-9所示。鸟苷通过5’-5’焦磷酸键与初级转录物的5’端相连。当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN时，此时形成的帽子被称为“帽0”，如果附m7G-PPNmN外，这个核糖的第“2”号碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，称为“帽1”，如果5’末端N1和N2中的两个核糖均甲基化，成为m7G-PPNmPNm2，称为“帽2”。从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出，生物进化程度越高，其帽子结构越复杂。

图17-9　Post-transcriptional modification of mRNa showing the 7-methylguanosine cap and poly-A tail.

　　真核生物mRNA 5’端帽子结构的重要性在于它是mRNa 做为翻译起始的必要的结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号，这种帽子结构还可能增加mRNA的稳定性，保护mRNa 免遭5’外切核酸酶的攻击。

　　2．在3’端加尾

　　大多数的真核mRNA 都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大约为200bp。

　　多聚（A)屠巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。受polyA聚合酶催化，该酶能识别，mRNa 的游离3’-OH端，并加上约200个A残基。

　　近年来已知，在大多数真核基因的3’一端有一个AATAA序列，这个序列是mRNa 3’-端加polyA尾的信号。靠核酸酶在此信号下游10-15碱基外切断磷酸二酯键，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200个A碱基。关于polyA尾巴的功能问题尽管经过极其广泛的探索，但还不完全清楚。有人推测polyA可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关，但是相当数量，的没有polyA屠巴的mRNA如组蛋白mRNA，也照样通过核膜进入细胞质。还有人认为这种结构对真核mRNA的翻译效率具有某种作用，并能稳定mRNA结构，保持一定的生物半衰期。

　　3.mRNA前体（hnRNA）的拼接

　　原核生物的结构基因是连续编码序列，而真核生物基因往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物结构基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它结构基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后，切去内元，将有编码意义的核苷酸片段（Extron外元也叫外显子）连接起来（图17-10）。

图17-10　Primary polymerase 11transcript of a eukaryote gene showing (a)introns after capping and addition of polyA tail.(b)Excision of introns to form the mature mRNA is called splicing.

　　真核生物的结构的基因中具有可表达活性的外显子，也含有无表达活性的内含子，但内含子序列下是无意义的，越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参与基因表达调控，在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。在细胞核中hnRNA进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA，这就是剪接作用，也有少数基因的hnRNA不需进行剪接作用，例如α-干扰素基因，图17-11以卵清蛋白基因为例，介绍一个典型的转录及加工过程。

图17-11　卵清蛋白基因转录及加工过程

图中外显示以1、2、3、4……表示，内含子以A、B、C、D…表示

　　mRNA的拼接，需要在拼接部位有供拼接识别的保守性强的一致顺序，通过对100多种真核细胞基因的分析，发现外元和内元拼接部位部分碱基顺序有一定的规律（见表17-4）。

表17－4　含有内元的转录产物其拼接处的碱基顺序

　　表中划线的碱基对拼接识别有重要作用，如将兔的β-珠蛋白的拼接部位的GT改为AT后，拼接反应即受到影响。

　　mRNA前体拼机制

图17-12　The RNA splicing mechanism.RNA splicing is catalyzed by a spliceosome formed from the assembly of U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as green circles )plus other components (not shown).After assembly of the spliceosome ,the reaction occures in two speps:in step 1the branch-point A nucleotide in the intron sequence,which is located colse to the 3'splice site ,attacks the 5'splice site and cleaves it;the cut 5'end of the intron sequence thereby becomes covalently linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotide shown in Figure 8-55.In step 2 the 3'-OH end of the first exon sequence,which was created in the first step,adds to the beginning of the second exon sequence,cleqving the RNA molecule at the 3'splice site;the two exon sequences are thereby joined to each other and the intron sequence is released ad a ribosone.These splicing reactions occur im the nucleus and gengerate mRNa molecules from primary RNA transcripts (mRNA precursor molecules).

　　mRNA拼接反应需要有核内小分子RNA参与它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒，SnRNA分别被命名为U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。SnRNA中的U2RNA由与内元右端拼接部位附近的UACUAA顺序高度互补，形成一个环状结构，由特定的酶来识别切除该环状结构，完成拼接过程，如图17-12所示。

图17-13　Mechanim of mRNa splicing.Note that,for clarity,the process is shown in two stages;energy is not required for the process since transesterification reactions are involved.

　　真核生物 mRNA前体在剪接过程中，还可以形成套索样的结构，在内含子序列中常有一个分支部位的腺苷酸残基，它的2’-OH可以自动攻击内含子5’端与外显子1连接的磷酸二酯键，切开了外噗子1，而腺苷酸原来已有3’，5’--磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基，加上此3’，5’-磷酸二酯键连接后，在腺苷酸处出现了一个套索，已被切下的外显子1的3’-OH攻击内含子3’末端与外显子2之间的3’，5’-磷酸二酯键，键断裂后，内含子以套索的形式被节下来，此时外显子1和外显子2可以连接起来（图17-13）。

　　不论拼接过程如何，拼接必须极为精确，否则会导致遗传信息传递障碍，合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。我国南方广大地区是β-地中海贫血的高发区，这是由于β-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。实验表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序，结果造成错误部位的拼接。加工成熟的mRNA虽能翻译，但产物不是正常的β-珠蛋白，结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。

　　（二）rRNA转录后加工

　　原核生物rRNA转录后加工，包括以下几方面：①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基（见图17-14）

图17-14　大肠杆菌rRNA前体的加工

　　真核生物rRNA前体比原核生物大，哺乳动物的初级转录产物为45s，低等真核生物的rRNA前体为38s，真核生物5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录（图17-15)。

图17-15　真核生物rRNA前体的加工

　　真核生物rRNA前体中含有插入顺序，rRNA前体要形成成熟的rRNA，需要经过拼接反应。例如，四膜虫的rRNA前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。四膜虫基因组内，26srRNA编码的区域内有413bp的插入顺序。该插放序列可以不消耗能量从rRNA前体中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性办法，都不能破坏拼接活性，但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP进行追踪实验表明，起始过程是GTP在插入顺序5’端发生亲核反应，同时GMP与5’端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。第二步是5’切点的外元3’-OH与3’切点的外元5’-P共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一个环状结构，同时从5’端去掉一个15核苷酸啐片。剩余部分连接成399核苷酸的环状产物，再经过几步，最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的（图17-16）。

图17-16　四膜虫rRNA前体的自我剪接

　　这种rRNA的自身剪接反应给人们一个提示：即RNA分子也有酶的催化活性。这向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。这种有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme。T.Cech和S.Altman各自分别发现RNA具有催化作用，他们的发现对于了解生命进行过程有重要意义。很可能在原始生命中，RNA所催化的断裂一连接反应是最早出现的催化过程。为此，他们共同获得了1989年Nobel化学奖。

　　从大多数Ribozymw的结构中发现一些特征，例如：锤头状结构的RNA分子有13个保守的核苷酸序列，如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。根据这种特片，科学家们在体外没计并人工合成这种RNA分子，用于抗肿瘤及抗病毒的实验中（图17-17）。

图17-17　锤头结构模式图

　　（三）tRNA转录后的加工修饰

　　原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行①剪切和拼接②碱基修饰③3’-OH连接-ACC结构（图17-18）。

图17-18　tRNA前体的加工

　　①tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大肠杆菌RNase P可特异剪切tRNA前体的5’旁顺序，因此，该酶被称为tRNA5’成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前体的剪切尚需要一个3’-核酸内切酶，这可将tRNA前体3’端的一段核苷酸序列切下来。此外RNaseD是tRNA3’端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌RNaseP是一种非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白质组成，最近发现RNAaseP分子中的RNA部分在某些条件下，可以单独地催化tRNA前体的加工成熟，这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明RNA分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。

　　②成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基，因此tRNA在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸（Ⅰ）

　　③3’末端加上CCA：在核苷酸转移酶作用下，3’--末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。